一种基于外泌体的光控信号放大技术及其在microRNA检测及成像中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于外泌体的光控信号放大技术及其在microRNA检测及成像中的应用，该方法通过发卡链上的疏水基团使三个发卡链固定于外泌体膜上，将载有探针的外泌体与细胞孵育后，紫外光照一定时间，使光控发卡链H2、H3上的光控基团断裂(光剪切)，使探针从外泌体上切下，当存在目标miRNA时，三个发卡链与目标miRNA发生HCR反应，由于发卡链H1不含光控基团，依然会固定在外泌体上，因此会在外泌体膜上进行HCR回收荧光聚集，从而可以通过激光共聚焦显微镜实现较好的细胞成像效果。聚焦显微镜实现较好的细胞成像效果。

【技术实现步骤摘要】
一种基于外泌体的光控信号放大技术及其在microRNA检测及成像中的应用


[0001]本专利技术属于基因检测领域，具体涉及一种基于外泌体的光控信号放大技术及其在microRNA检测及成像中的应用。

技术介绍

[0002]MicroRNA(miRNA)是一类长度约为19～23个碱基长度的非编码RNA，广泛参与动物、植物以及细菌病毒的后转录过程，调节基因的表达。miRNA的异常表达可能与疾病的发生有关，尤其与癌症关联密切，可以作为一种成熟的肿瘤标志物。在一些临床治疗中，miRNA也会被作为潜在的基因治疗及药物治疗的靶点，具有极为广阔的利用范围。而灵敏可靠的miRNA检测方法则是miRNA的进一步研究和开发的必要基础。
[0003]相关技术中，miRNA体外检测方法仍存在诸多缺陷，例如，常规的miRNA体外检测方法的检测结果均是平均表达值，无法反映miRNA在单个细胞的表达水平。而其他相对先进的方法，如荧光原位杂交技术(FISH)，在低浓度目标检测时灵敏度较低，对样品的要求较高，适用性差。使用滚环扩增方法结合FISH 荧光成像技术，虽然在一定程度上可实现细胞内的高灵敏可视化检测，但需要引入聚合酶，从而无法实现活细胞内成像检测，极大的限制了应用范围。
[0004]因此，为了解决相关技术中存在的缺陷，提高miRNA检测方法的准确性，开发一种能够适用于活细胞及胞外体系的适用性强的miRNA检测方法，对于miRNA的进一步研究和开发、以及疾病诊断与治疗具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种基于外泌体的光控信号放大技术(LRT
‑
HCR)，该方法能够以外泌体作为探针递送载体，将探针提送至活细胞内，该方法具有较高的转染效率，生物相容性好，细胞内的杂交链反应(HCR)产物能够聚集在外泌体上实现信号的再一次放大，从而提高细胞内成像的灵敏度。
[0006]本专利技术的第一个方面，提供一种检测核酸分子的探针组合。
[0007]根据本专利技术的第一个方面，在本专利技术的一些实施方式中，所述探针组合中包括发卡链H1、发卡链H2和发卡链H3；
[0008]所述发卡链H1从5
’
到3
’
依次包括：序列A，序列B，序列C和序列D；
[0009]所述序列A、B能够与靶核酸互补；
[0010]所述序列B能够与序列D互补；
[0011]所述序列C、D与所述发卡链H2的5
’
端序列互补；
[0012]所述发卡链H2从5
’
到3
’
依次包括：序列E，序列F，序列G和序列H；
[0013]所述序列F与所述序列H互补；
[0014]所述序列G、H与所述发卡链H3的3
’
端序列互补；
[0015]所述发卡链H3从5
’
到3
’
依次包括：序列I，序列J，序列K和序列L；
[0016]所述序列I与所述序列K互补；
[0017]所述序列L、K与所述发卡链H2的序列G、H互补。
[0018]其中，序列A为：TCAACA；序列B为TCAGTCTGATAAGCTA(SEQIDNO.1)；序列C为AATCTCTATCTACCCTAC(SEQIDNO.2)；序列D为AGCTTATCAGACT(SEQIDNO.3)；序列E为GCTGTA；序列F为GGGTAGATAGAGATTT(SEQIDNO.4)；序列G为AAATCA；序列H为TATCAAAATCTCTATCTACCC(SEQIDNO.5)；序列I为AAATCTCTATCTACCCTA(SEQIDNO.6)；序列J为CAGCTT；序列K为TGGGTAGATAGAGATTT(SEQIDNO.7)；序列L为TGATATGAT(SEQIDNO.8)。
[0019]各序列对应关系如说明书附图图1所示。
[0020]在本专利技术的一些优选实施方式中，当待测核酸为miR
‑
21时，发卡链H1、H2和H3，其具体的核苷酸序列为：
[0021]发卡链H1：5
’‑
TCAACATCAGTCTGATAAGCTAAATCTCTATCTACCCTACAGCTTATCAGACT
‑3’
(SEQIDNO.10)；
[0022]发卡链H2：5
’‑
GCTGTAGGGTAGATAGAGATTTAAATCATATCAAAATCTCTATCTACCC
‑3’
(SEQIDNO.11)；
[0023]发卡链H3：5
’‑
AAATCTCTATCTACCCTACAGCTTTGGGTAGATAGAGATTTTGATATGAT
‑3’
(SEQIDNO.12)。
[0024]在本专利技术的一些优选实施方式中，所述发卡链H2上修饰有第一荧光基团，所述发卡链H3上修饰有第二荧光基团，且所述第一荧光基团与所述第二荧光基团之间能发生荧光共振能量转移。
[0025]在本专利技术的一些更优选实施方式中，所述第一荧光基团为FAM；所述第二荧光基团为羧基罗丹明(TAMRA)。
[0026]在本专利技术的一些优选实施方式中，所述发卡链H1的3
’
端连接有胆固醇基团。
[0027]外泌体是一种具有磷脂双分子层的小囊泡，通过在发卡链上连接疏水基团胆固醇可以将发卡链自发嵌入到外泌体膜上，从而实现了外泌体自组装负载探针进入细胞。
[0028]发卡链H1作为外泌体上的锚定链，其3
’
端连接的胆固醇基团Chol会与外泌体膜结合，从而将发卡链H1锚定在外泌体上。而且发卡链H1受到miR
‑
21引发后会产生粘性末端，产生的粘性末端能够引发H2、H3进入级联杂交反应。而在整个HCR体系中，发卡链H2和H3是重复循环的扩增单元。
[0029]在本专利技术的一些优选实施方式中，发卡链H1的完整序列为：5
’‑
TCAACATCAGTCTGATAAGCTAAATCTCTATCTACCCTACAGCTTATCAGACTTTTTT
‑
Chol
‑3’
。
[0030]连接有TAMRA的发卡链H3的序列为：5
’‑
AAATCTCTATCTACCCTACAGC
‑
TAMRA
‑
TTTGGGTAGATAGAGATTTTGATATGAT
‑3’
。
[0031]根据本专利技术的第一个方面，在本专利技术的一些实施方式中，所述发卡链H2在3
’
端依次连接光控基团和胆固醇基团；所述发卡链H3在3
’
端依次连接光控基团和胆固醇基团。
[0032]根据本专利技术的第一个方面，在本专利技术的一些实施方式中，所述光控基团具有本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测核酸分子的探针组合，其特征在于，所述探针组合中包括发卡链H1、发卡链H2和发卡链H3；所述发卡链H1从5
’
到3
’
依次包括：序列A，序列B，序列C和序列D；所述序列A、B能够与靶核酸互补；所述序列B能够与序列D互补；所述序列C、D与所述发卡链H2的5
’
端序列互补；所述发卡链H2从5
’
到3
’
依次包括：序列E，序列F，序列G和序列H；所述序列F与所述序列H互补；所述序列G、H与所述发卡链H3的3
’
端序列互补；所述发卡链H3从5
’
到3
’
依次包括：序列I，序列J，序列K和序列L；所述序列I与所述序列K互补；所述序列L、K与所述发卡链H2的序列G、H互补；其中，序列E优选为GCTGTA；序列F优选为GGGTAGATAGAGATTT；序列G优选为AAATCA；序列H优选为TATCAAAATCTCTATCTACCC；序列I优选为AAATCTCTATCTACCCTA；序列J优选为CAGCTT；序列K优选为TGGGTAGATAGAGATTT；序列L优选为TGATATGAT。2.根据权利要求1所述的探针组合，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹小勇，张艳飞，戴宗，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：