本发明专利技术公开了GL
【技术实现步骤摘要】
GL-V9在制备预防和/或治疗脓毒症药物中的应用
[0001]本专利技术公开了汉黄芩素衍生物GL-V9在制备预防和/或治疗脓毒症药物中的应用，属于GL-V9新用途
技术介绍
[0002]炎症是生物组织受到外伤、感染等损伤因子的刺激所发生的一种以防御反应为主的基本病理过程。一直以来，炎症被认为是一种机体自我保护的机制。但炎症反应的持续存在会导致机体组织损伤，损害机体正常生理功能。
[0003]脓毒症就是一种机体对感染的反应失调而导致危及生命的器官功能障碍性疾病。脓毒症病程发展迅速、病情严重、病死率高。目前是全球人口死亡的主要原因之一。通常，脓毒症可以由身体任何部位的感染引起，包括由严重烧伤、腹膜炎、脓肿，以及由于病原微生物包括细菌、真菌等感染所引起的全身性反应综合征。临床上，患者会出现低血压、心动过速、和呼吸急促、急性肺损伤、肾损伤、进而出现脓毒性休克甚至死亡。脓毒症的病理生理学过程涉及复杂的细胞因子释放和炎症反应发生过程，其发病与先天性免疫系统的过度激活所造成的危害密切相关。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌外膜的主要成分。先天免疫系统通过监测LPS识别革兰氏阴性细菌。当LPS进入细胞，在细胞质中LPS的脂质A(Lipid A)结构域与半胱氨酸天冬蛋白酶-11(Caspase-11)的caspase募集结构域(CARD)结构域结合，激活Caspase-11，引发细胞焦亡，细胞焦亡所导致的细胞炎症因子的大量释放，继而会造成组织器官的损伤，最终会引发脓毒性休克甚至死亡。巨噬细胞作为先天性免疫细胞中重要的成员，在脓毒症过程中巨噬细胞的大量焦亡是造成病情恶化的主要原因。因此，抑制巨噬细胞焦亡，寻找安全、有效的抗炎药物对于治疗脓毒症具有重要意义。
技术实现思路
[0004]为解决上述技术问题，本专利技术提供了GL-V9在制备预防和/或治疗脓毒症药物中的应用，为开发治疗脓毒症的药物提供依据。
[0005]为达到上述专利技术目的，本专利技术技术方案如下：
[0006]本专利技术的第一个目的是提供一种汉黄芩素衍生物GL-V9在制备预防和/或治疗脓毒症药物中的应用，所述GL-V9分子式为C
24
H
27
NO5，结构式如式Ⅰ所示：
[0007][0008]进一步的，所述药物为通过减弱巨噬细胞焦亡程度从而预防和/或治疗脓毒症的药物。
HCl缓冲液(1.5M，pH6.8)、10
×
Tris-甘氨酸电泳缓冲液、10
×
印记膜转印缓冲液、丽春红染液购自上海生工生物工程股份有限公司。
[0046]Tween-20：南京化学试剂一厂。
[0047]PBST溶液：1mL Tween-20溶于1000mL PBS溶液中，搅拌混匀，于室温保存。
[0048]牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA):美国Sigma-Aldrich公司。按质量比用PBST缓冲液配置1％的蛋白溶液，现配现用。
[0049]增强型ECL化学发光检测试剂盒：上海天能科技有限公司。
[0050]2.实验仪器：
[0051]1)1300系列A2型生物安全柜：美国Thermo Fisher Scientific公司。
[0052]2)3111型水套式CO2培养箱：美国Thermo electron公司产品。
[0053]3)DP73型生物显微镜：日本Olympus公司。
[0054]4)FA2004型电子天平：上海良平仪器仪表有限公司。
[0055]5)Centrifuge 5810R型离心机：德国Eppendorf公司产品。
[0056]6)CMax Plus滤光片型光吸收酶标仪：美谷分子仪器(上海)有限公司。
[0057]7)Tanon 5200全自动化学发光图像分析系统：上海天能科技有限公司。
[0058]8)Applied Biosystems 7500Fast Real-time PCR系统购自Perkin-Elmer公司。
[0059]9)VE-180B型电泳槽：上海天能科技有限公司。
[0060]10)Mini-protean Tetra System全湿型转膜槽：美国BIO-RAD公司。
[0061]3.实验方法：
[0062](1)细胞活性检测实验
[0063]CCK-8法利用了Dojindo开发的四唑盐-WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2，4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)，它在电子载体1-Methoxy PMS(1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯)存在的情况下能够被还原成水溶性的甲臜染料。CCK-8溶液可以直接加入到细胞样品中：不需要预配各种成分。CCK-8法是用于测定细胞增殖或毒性试验中活细胞数目的一种高灵敏度，无放射性的比色检测法。WST-8被细胞内脱氢酶生物还原后生成的橙色甲臜染料能够溶解在组织培养基中，生成的甲臜量与活细胞数量成正比。
[0064]在96孔板中接种J774A.1细胞悬液(100μL/孔)，将培养板放在培养箱中预培养一段时间(37℃，5％CO2)，当细胞密度达到60％左右时，将细胞分为无细胞的背景空白对照组，阴性对照组，模型组和给药组。
[0065]在脂质体2000转染脂多糖LPS入巨噬细胞模型中，模型组和给药组脂多糖LPS(500ng/ml)预处理6h后，脂质体2000转染脂多糖LPS(2μg/mL)，给药组同时给药GL-V9，给药组分为3个浓度小组，给药量为别为0.5μM、1μM、2μM，12h后，弃培养基，换新鲜培养基100μL，给药组的各孔再以与上次相同的给药量给药GL-V9 6h后，向每孔加入10μL CCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数)。将培养板在培养箱内孵育1-4小时。用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
[0066]在大肠埃希氏菌感染巨噬细胞模型中，给药组提前12h预给药GL-V9，给药组分为3个浓度小组，给药量为别为0.5μM、1μM、2μM，12h后，模型组与给药组大肠杆菌(感染复数＝25)感染0.5h，随后用庆大霉素(100μg/mL)处理1.5h，弃培养基，换新鲜培养基，给药组的各孔再以与上次相同的给药量给药GL-V9 6h后，向每孔加入10μL CCK-8溶液。将培养板在培
养箱内孵育1-4小时。用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
[0067]活力计算
[0068]细胞活力(％)＝[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×
100
[0069]A(加药)：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度
[0070]A(空白)：具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度
[0071]A(0加药)：具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度
[0072](2)LDH释放率检测实验
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.GL-V9在制备预防和/或治疗脓毒症药物中的应用，其特征在于，所述GL-V9结构式如式Ⅰ所示：2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为通过减弱巨噬细胞焦亡程度从而预防和/或治疗脓毒症的药物。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述巨噬细胞焦亡为Caspase-11所介导的巨噬细胞焦亡。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述Caspase-11所介导的巨噬细胞焦亡为脂质体2000转染脂多糖LPS转入巨噬细胞引起的巨噬细胞焦亡或大肠埃希氏菌感染巨噬...
【专利技术属性】
技术研发人员：卢娜，赵越，卜修民，郭青龙，赵凯，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：
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