一种双RNA病毒及双RNA病毒快速识别的方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体公开了一种双RNA病毒及双RNA病毒快速识别的方法和应用。所述双RNA病毒包括基因组A节段和基因组B节段，双RNA病毒全基因组序列包括VP1、VP2、VP3和VP4共4个ORF，所述基因组A节段含有两个基因间隔区，VP2和VP4的基因间隔区为1458bp

【技术实现步骤摘要】
一种双RNA病毒及双RNA病毒快速识别的方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种双RNA病毒及双RNA病毒快速识别的方法和应用。

技术介绍

[0002]自然界中存在着数量庞大的未知新型病毒种类，而人类认知的病毒只占所有潜在病毒类型的0.1％。因此，新发病毒性病原体的快速确认技术对于临床治疗及疫情防控至关重要。
[0003]大口黑鲈(Micropterus salmoides)是一种优质淡水鱼类。近年来，大口黑鲈平均培苗成活率仅为5％左右，主要是由于未知病原导致的鱼苗拖便、肠炎、打转、熟身等病症，造成鱼苗死亡率近100％，现已严重制约大口黑鲈养殖业的健康发展，已成为大口黑鲈养殖业发展的瓶颈问题。
[0004]目前，临床上传统的病毒检测方法主要包括基于病毒基因的各类(RT
‑
)PCR 分子检测方法和基于病毒抗原抗体的血清学检测。但这些方法的局限性是要提前预知病毒的基因序列或蛋白质序列信息，对于未知新型病毒则不能有效检出。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种双RNA病毒及双RNA病毒快速识别的方法和应用。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：
[0007]第一方面，本专利技术提供了一种双RNA病毒，所述双RNA病毒包括基因组 A节段和基因组B节段，双RNA病毒全基因组序列包括VP1、VP2、VP3和 VP4共4个ORF，所述基因组A节段含有两个基因间隔区，VP2和VP4的基因间隔区为1458bp
‑
1949bp，VP3和VP4的基因间隔区为2445bp
‑
2663bp。
[0008]作为本专利技术所述双RNA病毒的优选实施方式，所述基因组A节段的全长为 3525个核苷酸，所述基因组B节段的全长为2737个核苷酸。
[0009]作为本专利技术所述双RNA病毒的优选实施方式，所述基因组A节段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述基因组B节段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0010]更优选地，所述VP1、VP2、VP3和VP4编码的氨基酸序列长度分别为836 aa、422aa、220aa和165aa。
[0011]作为本专利技术所述双RNA病毒的优选实施方式，所述基因组A节段的 Genbank登录号为MW727622，所述基因组B节段的Genbank登录号为 MW727623。
[0012]第二方面，本专利技术提供了一种用于扩增上述双RNA病毒的扩增引物，所述扩增引物包括S1、S2、S3、S4、S5和S6引物，所述S1引物的序列如SEQ ID NO:3 和SEQ ID NO:4所示，所述S2引物的序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，所述S3引物的序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，所述S4引物的序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示，所述S5引物的
序列如SEQ ID NO:11 和SEQ ID NO:12所示，所述S6引物的序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14 所示。
[0013]第三方面，本专利技术提供了一种基于宏基因组测序快速识别上述的双RNA病毒的方法，包括以下步骤：
[0014]1)提取待测样本的DNA、RNA，分别构建样本的DNA、cDNA文库，得到样本测序文库；
[0015]2)对所述样本测序文库进行测序，之后对测序数据进行筛选，挑选在样品总重叠群中占比最大的病毒，即得上述的双RNA病毒。
[0016]第四方面，本专利技术提供了一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括上述的双 RNA病毒。
[0017]第五方面，本专利技术提供了上述疫苗组合物在预防和/或治疗病毒感染相关疾病的药物中的应用。
[0018]本专利技术收集了临床症状为拖便、肠炎的发病大口黑鲈鱼苗，通过病毒宏基因组分析，发现疑似病原为一种双RNA病毒(Birnavirus)，进一步采用病原的分离鉴定、电镜观察、回归感染实验等方法确定该病的病原为大口黑鲈双RNA 病毒(Largemouth bass birnavirus，LBBV)。本专利技术通过病毒宏基因组技术缩小了未知病原的范围，大大提高了确定未知病原的工作效率，为其他未知病原的确定提供了一种新的快速有效的技术方法。
[0019]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0020]1)本专利技术鉴定了引起拖便、肠炎的发病大口黑鲈症状的病毒病原为一种新的双RNA病毒，并获取了该病毒的全基因组序列，为后期该病毒的研究及病害的防治打下基础；
[0021]2)本专利技术涉及的灭活疫苗具有较好的免疫保护效果，可以为该病的免疫预防奠定基础。
附图说明
[0022]图1为采集得到的发病大口黑鲈症状图(靠近鱼头的箭头表示肝脏有出血点；靠近鱼尾的箭头表示肠道有黄色粘液)；
[0023]图2为病毒核酸在科水平上的病毒注释统计图；
[0024]图3为病毒在不同细胞系中的细胞病变效应图(CCO细胞(图3
‑
(1
‑
a)、图 3
‑
(1
‑
b))、CIK细胞(图3
‑
(2
‑
a)、图3
‑
(2
‑
b))、CPB细胞(图3
‑
(3
‑
a)、图3
‑
(3
‑
b))、 EPC细胞(图3
‑
(4
‑
a)、图3
‑
(4
‑
b))、FHM细胞(图3
‑
(5
‑
a)、图3
‑
(5
‑
b))、PSF细胞(图3
‑
(6
‑
a)、图3
‑
(6
‑
b))；(g)
‑
(i)分别为感染后0h、12h、16h的CPB细胞病变情况；1、2分别为对照组和感染组，图3右下标不清楚不影响文本的公开， 50μm)；
[0025]图4为病毒电镜图((a)
‑
(c)分别为发病大口黑鲈脾脏组织、感染CPB细胞的透射电镜；(d)纯化病毒负染图，右下标不清楚不影响文本的公开)；
[0026]图5为病毒基因组电泳图；
[0027]图6为LBBV的VP1蛋白系统进化树分析图；
[0028]图7为LBBV回归感染大口黑鲈的临床症状图(下方图的箭头表示肝脏有出血点；上方图中间箭头表示肠道有黄色粘液；鱼尾箭头表示尾鳍发黑)；
[0029]图8为采用不同感染方式对大口黑鲈致死效果的实验结果图；
[0030]图9为LBBV在大口黑鲈体内的组织分布图(1
‑
9分别为肝脏、脾脏、肾脏、胃、肠、心
脏、鳃、脑和肌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双RNA病毒，其特征在于，所述双RNA病毒包括基因组A节段和基因组B节段，双RNA病毒全基因组序列包括VP1、VP2、VP3和VP4共4个ORF，所述基因组A节段含有两个基因间隔区，VP2和VP4的基因间隔区为1458bp
‑
1949bp，VP3和VP4的基因间隔区为2445bp
‑
2663bp。2.如权利要求1所述的双RNA病毒，其特征在于，所述基因组A节段的全长为3525个核苷酸，所述基因组B节段的全长为2737个核苷酸。3.如权利要求1或2所述的双RNA病毒，其特征在于，所述基因组A节段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述基因组B节段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。4.如权利要求1或2所述的双RNA病毒，其特征在于，所述基因组A节段的Genbank登录号为MW727622，所述基因组B节段的Genbank登录号为MW727623。5.一种用于扩增权利要求1所述的双RNA病毒的扩增引物，其特征在于，所述扩增引物包括S1、S2、S3、S4、S...

【专利技术属性】
技术研发人员：李宁求，付小哲，罗明菊，林强，梁红茹，刘礼辉，牛银杰，罗霞，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院珠江水产研究所，
类型：发明
国别省市：