一种基于马脑炎病毒的溶瘤病毒及其用途制造技术

本公开涉及一种基于马脑炎病毒的溶瘤病毒及其用途，所述溶瘤病毒为具有功能失活的衣壳蛋白基因的委内瑞拉马脑炎病毒。所述溶瘤病毒还可以作为一种表达载体，用于外源基因的表达。所述溶瘤病毒在多种肿瘤细胞及小鼠荷瘤模型中具有显著的溶瘤作用，可以为临床肿瘤的治疗提供一种有效的抗癌治疗剂，具有良好的应用前景。前景。

【技术实现步骤摘要】
一种基于马脑炎病毒的溶瘤病毒及其用途


[0001]本公开属于生物
，本公开涉及一种基于马脑炎病毒的溶瘤病毒及其用途，更具体地，涉及一种缺失衣壳蛋白基因的委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒及其作为溶瘤病毒的用途。

技术介绍

[0002]肿瘤是人类面临的最大公共健康问题，也是引起死亡的第二大杀手。恶性肿瘤已经成为严重威胁中国以及全世界人群健康的主要公共卫生问题之一。目前针对肿瘤的治疗主要包括两类，一类是包括化疗/放疗/手术治疗的传统治疗方法，另一类是以细胞因子/免疫细胞及抗体为主的免疫治疗。但不管是传统治疗还是免疫治疗，都存在治疗缺陷。传统治疗最大的缺点是药物的耐药，而免疫治疗最大的缺陷是应答率低。因此，新型治疗手段，如肿瘤免疫治疗/溶瘤病毒等逐渐受到人们的重视。
[0003]溶瘤病毒是一类具有直接杀死肿瘤细胞和/或激活肿瘤免疫应答作用的天然病毒或重组病毒。与正常细胞相比，溶瘤病毒优先在肿瘤细胞中感染和复制，从而引起肿瘤细胞裂解。除直接溶瘤外，溶瘤病毒还可以作为免疫原激活先天性和适应性抗肿瘤免疫应答，导致免疫细胞有效浸润，将免疫细胞少的“冷”肿瘤微环境(TME)转化为免疫细胞多的“热”肿瘤微环境，从而增强机体识别、控制和杀死肿瘤细胞的能力。近年来，随着癌症领域朝着基于生物和免疫的方法对抗癌症的方向发展，溶瘤病毒受到了越来越多的关注。目前，多数研究通过改造一些自然界存在的致病力较弱的毒种，使其特异的在肿瘤细胞中表达包装继而实现溶瘤作用。且与天然病毒相比，具有溶瘤作用的减毒活疫苗具有安全，可控，易于生产等优势。有研究表明黄热病疫苗YFV
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17D复制并杀死小鼠和人类肿瘤细胞系，但不会杀死未转化的人类细胞。肿瘤内注射具有活性的YFV
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17D可以显着抑制CD 8+T细胞依赖的移植肿瘤进程，从而产生免疫介导的抗肿瘤作用，最终以溶瘤病毒的方式发挥抗肿瘤作用。同样的，研究表明间质性脊髓灰质炎病毒减毒活疫苗Pvsripo在神经胶质瘤的治疗中具有显著作用。Pvsripo病毒通过脊髓灰质炎病毒受体CD155特异性进入神经胶质瘤细胞，并在肿瘤细胞中扩增最终诱导肿瘤细胞的裂解死亡。
[0004]委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)自1943年以来就被认为是人类病原体，会引起类似流感的症状以及一些中枢神经系统疾病，例如脑炎和脑膜炎。VEEV是一种新世界alpha病毒，此病毒在蚊子、野生啮齿动物以及人类和马之间流行病周期。主要分布在美洲，主要爆发地位于中关洲和南美洲。VEEV的爆发可能导致马匹致命死亡。1995年在委内瑞拉和哥伦比亚发生的此病毒的爆发，但自1995年以来，该病毒尚未爆发，也未引起人类致病。减毒活疫苗是通过在细胞培养中连续传代或通过在病毒基因组中诱导突变而得到的一类疫苗。VEEV减毒活疫苗TC
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83是用于人类疫苗接种的第一个VEEV减毒株，它是由VEEV的TrD株在豚鼠心脏细胞中传代83次产生的。TC
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83与亲本TrD株的区别在于其产生的11个点突变和一个核苷酸的丢失。TC
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83的减毒的主要原因其中两个突变的形成，即5
′‑
UTR区域第3位点的G突变为A，以及E2蛋白120位氨基酸Thr突变为Arg。
[0005]目前尚未有基于马脑炎病毒的溶瘤病毒并将其用于治疗肿瘤的相关报道。

技术实现思路

[0006]本公开的目的在于克服现有技术中存在的缺陷与不足，提供了一种基于马脑炎病毒的溶瘤病毒，所述溶瘤病毒具有广谱的溶瘤作用，可以用于治疗多种肿瘤。
[0007]在一方面，本公开提供了一种基于马脑炎病毒的溶瘤病毒，所述溶瘤病毒为具有功能失活的衣壳蛋白基因的马脑炎病毒。
[0008]在一方面，本公开提供了一种DNA，所述DNA可被转录而产生所述的溶瘤病毒。
[0009]在一方面，本公开提供了一种细胞，所述细胞包含所述溶瘤病毒或DNA。
[0010]在一方面，本公开提供了一种组合物，所述组合物包含所述溶瘤病毒、DNA和/或所述细胞。
[0011]在一方面，本公开提供了一种所述溶瘤病毒、所述DNA、所述细胞和/或所述组合物在制备用于治疗肿瘤和/或癌症的药物中的用途。
[0012]所述溶瘤病毒还可作为表达载体，用于外源基因的表达。本公开的溶瘤病毒的遗传稳定性高，并在在多种肿瘤细胞及小鼠荷瘤模型中证实所述溶瘤病毒具有显著的溶瘤作用，可以为临床肿瘤的治疗提供一种有效的抗癌治疗剂，具有良好的应用前景。
附图说明
[0013]图1为缺失衣壳蛋白基因的委内瑞拉马脑炎病毒疫苗株TC
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83感染性克隆的构建示意图及由感染性克隆拯救出的重组病毒的间接免疫荧光示意图，其中，A：缺失衣壳蛋白基因(VEEV
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delC)感染性克隆的构建示意图；B：VEEV
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delC转染BHK
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21细胞后不同时间点间接免疫荧光图；C：VEEV
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delC感染BHK
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21细胞后96h间接免疫荧光图。
[0014]图2为VEEV
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delC病毒遗传稳定性检测示意图，其中，A：RT
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PCR比较野生型病毒VEEV
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TC83(VEEV
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wt)、P0代(VEEV
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delC)、B株的P10代(VEEV
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delC
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B
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P10)、B株的P11代(VEEV
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delC
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B
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P11)、A株的P12代(VEEV
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delC
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A
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P12)、C株的P13代(VEEV
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delC
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C
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P13)的VEEV
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delC目的带大小；B：野生型病毒VEEV
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TC83(VEEV
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wt)及VEEV
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delC蚀斑形态比较；C：P13代的A、B和C三株VEEV
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delC病毒的生长曲线比较；D：P20代的VEEV
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delC病毒在BHK
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21及Vero细胞中的生长曲线比较；E：P30代不同MOI感染VEEV
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delC的生长曲线比较。
[0015]图3示出了VEEV
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delC对肿瘤细胞的溶瘤作用，其中，A：明场观察VEEV
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delC对肿瘤细胞的溶瘤作用；B：CCK8检测不同剂量VEEV
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delC对肿瘤细胞的溶瘤作用。
[0016]图4示出了体内检测VEEV
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delC单次给毒对小鼠黑色素瘤的溶瘤作用，其中，A：单次给毒对小鼠黑色素瘤模型治疗策略图；B：单次给毒给病毒治疗后本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于马脑炎病毒的溶瘤病毒，所述溶瘤病毒为具有功能失活的衣壳蛋白基因的马脑炎病毒。2.权利要求1所述的溶瘤病毒，其中，通过缺失、取代或插入使所述衣壳蛋白基因的功能失活；优选地，通过缺失至少一部分所述衣壳蛋白基因使其功能失活；更优选地，通过缺失全部所述衣壳蛋白基因使其功能失活。3.权利要求1或2所述的溶瘤病毒，其中，所述马脑炎病毒选自委内瑞拉马脑炎病毒、东部马脑炎病毒和西部马脑炎病毒；优选地，所述马脑炎病毒是委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)；优选地，所述溶瘤病毒是基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒；优选地，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒包含与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；优选地，所述溶瘤病毒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；优选地，所述溶瘤病毒在SEQ ID NO.1所示核苷酸序列存在选自以下突变中的一种或多种突变：第2490位存在a到t突变、第3100位存在c到t突变、第4809位存在t到a突变、第7461位存在a到g突变、第8440位存在g到a突变、第8627位存在t到c突变、第10255位存在a到t突变和10336位存在a到t突变；优选地，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒的核苷酸序列在SEQ ID NO.1所示核苷酸序列中存在第2490位存在a到t突变、第3100位存在c到t突变、第4809位存在t到a突变和第7461位存在a到g突变；优选地，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒的核苷酸序列在SEQ ID NO.1所示核苷酸序列中存在第8440位存在g到a突变、第8627位存在t到c突变、第10255位存在a到t突变和10336位存在a到t突变；优选地，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒的核苷酸序列在SEQ ID NO.1所示核苷酸序列中存在第2490位存在a到t突变、第3100位存在c到t突变、第4809位存在t到a突变、第7461位存在a到g突变、第8440位存在g到a突变、第8627位存在t到c突变、第10255位存在a到t突变和10336位存在a到t突变；优选地，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒编码的蛋白具有选自以下的一种或多种的突变：E1蛋白具有N360Y突变；E1蛋白具有I387F突变；E2蛋白具有D234N突变；E2蛋白具有I296T突变；nsp2蛋白具有K281E突变；nsp2蛋白具有P484L突变；nsp3蛋白具有S260T突变；nsp4蛋白具有T587A突变；优选地，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒编码的E1蛋白具有N360Y和I387F突变；
优选地，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒编码的E2蛋白具有D234N和I296T突变；优选地，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒编码的nsp2蛋白具有K281E和P484L突变；优选地，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒编码的nsp3蛋白具有S260T突变；优选地，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒编码的nsp4蛋白具有T587A突变；优选地，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒编码的E1蛋白具有N360Y和I...

【专利技术属性】
技术研发人员：张波，刘静，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所，
类型：发明
国别省市：