一种筛选高表达FAD-GDH重组毕赤酵母菌株的方法技术

本发明专利技术提供了一种筛选高表达FAD

【技术实现步骤摘要】
一种筛选高表达FAD
‑
GDH重组毕赤酵母菌株的方法


[0001]本专利技术涉及酵母菌株筛选的
,更具体的说是涉及一种筛选高表达FAD
‑
GDH的重组毕赤酵母菌株的方法。

技术介绍

[0002]FAD依赖的葡萄糖脱氢酶(FAD
‑
dependent glucose dehydrogenase，简称FAD
‑
GDH，EC 1.1.99.10)，与葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，简称GOD)、吡喃糖脱氢酶、胆碱脱氢酶和甲醇氧化酶同属于GMC氧化还原酶(glucose
‑
methanol
‑
choline
‑
oxidoreductase)家族。它是以FAD为辅基能够在NAD(P)+等存在的情况下催化β
‑
D
‑
葡萄糖生成D
‑
葡萄糖酸
‑
δ
‑
内酯，而D
‑
葡萄糖酸
‑r/>δ
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种筛选高表达FAD
‑
GDH的重组毕赤酵母菌株的方法，其特征在于，具体步骤为：步骤一：利用前期获得的密码子偏好性优化的FAD
‑
GDH基因片段分别与表达载体pPICZαA、pMD连接，构建重组表达载体pPICZαA
‑
GDH和pMD
‑
GDH；步骤二：将pPICZαA
‑
GDH电转入毕赤酵母X33构建重组子，使用Zeocin及试管发酵筛选获得毕赤酵母重组菌株X33
‑
GDH
‑
2，将其制成感受态；步骤三：将pMD
‑
GDH电转入X33
‑
GDH
‑
2感受态细胞，利用G418浓度梯度平板和试管发酵进行筛选。2.根据权利要求1所述的一种筛选高表达FAD
‑
GDH的重组毕赤酵母菌株的方法，其特征在于，所述步骤一中重组质粒pMD
‑
GDH、pPICZαA
‑
GDH的构建具体方法为：目的基因FAD
‑
GDH连接在pUC57T载体上，3
’
和5
’
两端分别有EcoRI和NotI限制性酶切位点，中科院微生物研究所提供的pMD
‑
AOX质粒及pPICZαA质粒也存在这两个酶切位点，将pUC57
‑
GDH和实验室保存的pMD
‑
AOX质粒、pPICZαA分别进行EcoRI和NotI双酶切，酶切产物分别用1％琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收GDH目的基因及pMD空载、pPICZαA空载，得到有相同粘性末端的目的基因GDH和载体。用T4连接酶连接回收产物，连接后的产物转化入大肠杆菌DH5α感受态，对鉴定出的阳性克隆提取质粒进行酶切、测序，比对分析重组质粒构建成功。3.根据权利要求1所述的一种筛选高表达FAD
‑
GDH的重组毕赤酵母菌株的方法，其特征在于，所述步骤二中重组毕赤酵母产FAD
‑
GDH的菌株构建的具体方法为：重组质粒pPICZαA
‑
GDH采用SacI线性化后电转表达宿主Pichia pastoris X33，构建重组菌X33/pMD
‑
GDH，电转条件：4Kv，4
‑
5ms，快速加入1ml预冷的YPDS液体培养基，电转的感受态细胞置于30℃培养箱...

【专利技术属性】
技术研发人员：董聪，王玥，高庆华，罗同阳，王庆庆，刘攀，
申请(专利权)人：河北省微生物研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：