一种新型冠状病毒多肽高效偶联技术及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种新型冠状病毒多肽高效偶联技术及其应用，包括间接ELISA法，所述间接ELISA法包括以下操作步骤：S1：采用间接ELISA法，血清样品中的SARS

【技术实现步骤摘要】
一种新型冠状病毒多肽高效偶联技术及其应用


[0001]本专利技术涉及新型冠状病毒多肽高效偶联
，特别涉及一种新型冠状病毒多肽高效偶联技术及其应用。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒感染引发的新型冠状病毒肺炎(COVID
‑
19)疫情发展迅速，且确诊病例数不断增加。基于COVID
‑
19的强传染性，快速地筛查临床症状病例及疑似病例，并及时进行隔离被认为是疫情防控的有效手段。
[0003]在现有的针对SARS
‑
CoV
‑
2的实验室检测方法，血清抗体检测方法具有样本采集方便、操作简单的特点，是快速筛查和核酸辅助诊断的重要方法。目前针对SARS
‑
CoV
‑
2的特异性抗体检测技术主要有胶体免疫层析法、酶联免疫吸附法(ELISA)、化学发光法。
[0004]胶体免疫层析法操作简单、报告时间快，适用于快速筛查，但其检测灵敏度和准确度较化学发光法和酶联免疫吸附试验低；ELISA和化学发光法均有特异性强、灵敏度高的特点，在化学发光法的实际应用中常见的为磁微粒化学发光免疫分析法，其更具稳定性。ELISA、磁微粒化学发光免疫分析法可用于新型冠状病毒中和抗体的批量、快速检测，在临床检测中具有良好的发展前景。
[0005]生物素
‑
亲合素系统是一种新型生物反应放大系统，广泛应用于各种标记免疫分析技术。1个亲合素分子可结合4个生物素化分子，且结合亲和力极强、特异性高、稳定性好，是BAS多级放大作用的物质基础。链霉亲合素是一种与亲和素有相似生物学特性的大分子蛋白，其与固相材料的非特异性结合少于亲合素，故在实际应用中多采用生物素
‑
链霉亲合素系统。
[0006]活化生物素可与多种生物活性分子及示踪物结合形成生物素化衍生物，而链霉亲合素可连接示踪物(如酶、荧光素等)、固相载体(如磁颗粒)等。通过与示踪物牢固结合及多级放大效应，极大地提高了免疫检测和分析的敏感性。
[0007]在ELISA、磁微粒化学发光免疫分析法中引入生物素
‑
链霉亲合素系统，将链霉亲合素连接于固相载体表面，与生物化抗原结合，实现间接包被，可增加抗原包被数量，减少空间位阻效应，极大地提高了基于免疫方法的检测效率，更省时省材。

技术实现思路

[0008]本专利技术的主要目的在于提供一种新型冠状病毒多肽高效偶联技术及其应用，可以有效解决
技术介绍
中的问题。
[0009]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：
[0010]一种新型冠状病毒多肽高效偶联技术，包括间接ELISA法，所述间接ELISA法包括以下操作步骤：
[0011]S1：采用间接ELISA法，血清样品中的SARS
‑
CoV
‑
2抗体与固定在ELISA板的SARS
‑
CoV
‑
2抗原物质结合，洗涤除去非结合的抗原及杂质，再加入酶标二抗。通过加入与酶反应
的底物后显色，根据酶标仪OD450值可以判断样品中抗体的含量；
[0012]S2：相关试剂配制；
[0013]a1：封闭液，优选0.5％BSA的PBS液，0.22μm滤器过滤除菌，保存于4℃；
[0014]a2：洗涤液PBST，优选0.5％Tween20，PBS液，震荡混匀，室温保存；
[0015]a3：0.05mMCBBuffer，4.77gNa2CO3+8.82gNaHCO3，加入2L双蒸水充分搅拌；
[0016]a4：链霉亲和素包被酶标板，5μg/mL链霉亲和素加入微孔板，4℃孵育12h，取出微孔板，PBST液洗涤三次，加100μl/孔封闭液，置于37℃震荡孵育1h，随后用PBST液洗涤3次，即得到链霉亲和素包被的酶标板；
[0017]a5：辣根过氧化物酶HRP标记鼠抗人IgG单克隆抗体，HRP活化，称取2mgHRP溶解于500μl双蒸水，于上清液中加入0.5ml现配的0.06M过碘酸钠溶液，4℃避光反应30min；然后加入160MM的乙二醇溶液0.5ml，室温放置30min，上液中加2mg抗体，混匀后装入透析袋中，置于0.05mMCBBuffer中，4℃搅拌过夜透析，将透析后液体吸出至15ml离心管，加入0.2ml新配制的5mg/mlNaBH4，置于4℃2h，加入等量饱和硫酸铵溶液，混匀后置于4℃30min后，4℃、4000r离心20min，弃上清，将沉淀溶于PBS溶液中，装入透析袋，放入0.05mMCBBuffer透析液中，4℃搅拌过夜，中途更换透析液一次，透析完成后，将液体吸出，4℃、12000r离心20min，取上清和等量甘油混匀，
‑
20℃保存，HRP单克隆抗体混合比例为1:1，可将HRP标记的鼠抗人IgG抗体进行一定倍数的稀释(100μl/孔)，37℃孵育30min，PBST洗涤5次。
[0018]优选的，还包括磁微粒化学发光法，所述磁微粒化学发光法包括以下操作步骤：
[0019]T1：包被在磁微粒上的新型冠状病毒抗原与样本中的特异性IgG抗体结合，洗涤后加入吖啶酯标记的鼠抗人IgG抗体，形成免疫复合物，加入底物液，发生化学发光反应，产生的发光信号值与样本中特异性IgG抗体的含量呈正相关；
[0020]T2：相关试剂配制；
[0021]b1：链霉亲和素SA包被磁微粒，用4℃的MES溶液(0.1M，pH＝6.0)分别配制5mg/ml的EDC和NHS溶液，取10mg羧基修饰磁珠(所述的磁珠粒径为0.1
‑
5μm)，分别加入等体积的上述EDC和NHS溶液，置于垂直旋转混匀仪上保持磁珠悬浮，37℃活化45min，磁分离器回收磁珠，PBS液(0.02mol/L，pH8.0)洗涤3次后重悬；取活化后的磁珠与适量链霉亲和素进行偶联，每1mg磁珠中添加100mgSA进行偶联，37℃活化1h，磁分离器回收磁珠；加入PBS(优选含1％的BSA)溶液重悬磁珠，37℃封闭45min(30min
‑
1h)；PBS溶液洗涤磁珠3次，用PBST(含0.1％Tween20)保存缓冲液重悬，4℃保存；
[0022]b2：Biotin
‑
RBD抗原的制备，同上述间接ELISA法步骤；
[0023]b3：Biotin
‑
RBD抗原包被在SA磁微粒上，取100μlSA磁微粒悬浮液，加1mlBufferⅡ缓冲液重悬(PBSpH＝7.4，含0.05％的Tween
‑
20，可根据需要添加0.01％～0.1％BSA)，磁吸附去上清；加1mlBufferⅡ稀释的Biotin
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RBD抗原(使磁珠浓度为1mg/ml)，室温下旋转混匀反应60min，磁分离去上清，BufferⅡ洗涤3次；加适量BufferⅡ缓冲液，重悬至工作浓度，即得到Biotin
‑
RBD抗原包被的SA磁微粒；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新型冠状病毒多肽高效偶联技术，其特征在于：包括间接ELISA法，所述间接ELISA法包括以下操作步骤：S1：采用间接ELISA法，血清样品中的SARS
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CoV
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2抗体与固定在ELISA板的SARS
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CoV
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2抗原物质结合，洗涤除去非结合的抗原及杂质，再加入酶标二抗。通过加入与酶反应的底物后显色，根据酶标仪OD450值可以判断样品中抗体的含量；S2：相关试剂配制；a1：封闭液，优选0.5％BSA的PBS液，0.22μm滤器过滤除菌，保存于4℃；a2：洗涤液PBST，优选0.5％Tween20，PBS液，震荡混匀，室温保存；a3：0.05mMCBBuffer，4.77gNa2CO3+8.82gNaHCO3，加入2L双蒸水充分搅拌；a4：链霉亲和素包被酶标板，5μg/mL链霉亲和素加入微孔板，4℃孵育12h，取出微孔板，PBST液洗涤三次，加100μl/孔封闭液，置于37℃震荡孵育1h，随后用PBST液洗涤3次，即得到链霉亲和素包被的酶标板；a5：辣根过氧化物酶HRP标记鼠抗人IgG单克隆抗体，HRP活化，称取2mgHRP溶解于500μl双蒸水，于上清液中加入0.5ml现配的0.06M过碘酸钠溶液，4℃避光反应30min；然后加入160MM的乙二醇溶液0.5ml，室温放置30min，上液中加2mg抗体，混匀后装入透析袋中，置于0.05mMCBBuffer中，4℃搅拌过夜透析，将透析后液体吸出至15ml离心管，加入0.2ml新配制的5mg/mlNaBH4，置于4℃2h，加入等量饱和硫酸铵溶液，混匀后置于4℃30min后，4℃、4000r离心20min，弃上清，将沉淀溶于PBS溶液中，装入透析袋，放入0.05mMCBBuffer透析液中，4℃搅拌过夜，中途更换透析液一次，透析完成后，将液体吸出，4℃、12000r离心20min，取上清和等量甘油混匀，
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20℃保存，HRP单克隆抗体混合比例为1:1，可将HRP标记的鼠抗人IgG抗体进行一定倍数的稀释(100μl/孔)，37℃孵育30min，PBST洗涤5次。2.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒多肽高效偶联技术，其特征在于：还包括磁微粒化学发光法，所述磁微粒化学发光法包括以下操作步骤：T1：包被在磁微粒上的新型冠状病毒抗原与样本中的特异性IgG抗体结合，洗涤后加入吖啶酯标记的鼠抗人IgG抗体，形成免疫复合物，加入底物液，发生化学发光反应，产生的发光信号值与样本中特异性IgG抗体的含量呈正相关；T2：相关试剂配制；b1：链霉亲和素SA包被磁微粒，用4℃的MES溶液(0.1M，pH＝6.0)分别配制5mg/ml的EDC和NHS溶液，取10mg羧基修饰磁珠(所述的磁珠粒径为0.1
‑
5μm)，分别加入等体积的上述EDC和NHS溶液，置于垂直旋转混匀仪上保持磁珠悬浮，37℃活化45min，磁分离器回收磁珠，PBS液(0.02mol/L，pH8.0)洗涤3次后重悬；取活化后的磁珠与适量链霉亲和素进行偶联，每1mg磁珠中添加100mgSA进行偶联，37℃活化1h，磁分...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈泽良，易怀敏，陆家海，张力华，
申请(专利权)人：深圳蓝韵生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：