一种非洲猪瘟病毒p54阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种非洲猪瘟病毒p54阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用。该试剂盒包括包括以非洲猪瘟病毒p54蛋白为包被抗原的的酶联反应板和酶标抗体；所述酶标抗体为与非洲猪瘟病毒p54蛋白特异性结合的单克隆抗体制成的酶标抗体。本试剂盒采用非洲猪瘟病毒p54纯化蛋白和与非洲猪瘟病毒p54蛋白特异性结合的单克隆抗体制备的阻断法酶联免疫抗体检测试剂盒，灵敏度高、特异性强，可以有效地检测样品中非洲猪瘟病毒抗体的含量，与进口试剂盒符合率达95％以上，具有广阔的市场前景和良好的经济、社会效益。社会效益。

【技术实现步骤摘要】
一种非洲猪瘟病毒p54阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于生物检测
，更具体地，本专利技术涉及一种非洲猪瘟p54阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用，适用于非洲猪瘟抗体的特异、快速、准确检测。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的猪的一种急性、烈性、高度接触传染性疾病。非洲猪瘟在临床症状上与猪瘟极为相似，以高热、高死亡率、全身广泛性出血、呼吸障碍以及神经功能紊乱为主要特征，病死率高达100％。我国将其列为一类动物传染病。非洲猪瘟1921年于肯尼亚发现，2007年传入高加索地区和俄罗斯，2014年已传入东欧大部分国家，流行趋势扩大，2018年，我国首例非洲猪瘟在沈阳确诊并迅速蔓延，给我国养猪业造成巨大经济损失。
[0003]非洲猪瘟病毒是一种由囊膜包裹的双股线性DNA病毒。不同毒株基因组大小存在些许差异，长度介于170
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190Kb之间，有150多个主要开放阅读框，可编码150～200种蛋白质，其中结构蛋白为54种。其中p54蛋白由E183L基因编码，位于病毒粒子内层囊膜，是ASFV的主要结构蛋白，也是血清抗体的主要结合位点，具有较好的免疫原性，可作为非洲猪瘟血清学检测的诊断抗原。
[0004]由于对ASFV的生物学特性研究不充分，目前还没有研发出针对非洲猪瘟特别有效的疫苗，对非洲猪瘟的防控主要依赖于动物检疫，但非洲猪瘟与猪瘟临床症状极为相似且作为我国的新发病，国内相应的检测产品尚属于空白状态，因此研发出一款简便、快捷、高效的检测试剂变得尤为重要。
[0005]酶联免疫吸附试验(Enzyme
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Linked ImmunosorbentAssays,ELISA)是市场上主流的免疫测定技术，已广泛应用于临床检测，快速便捷且灵敏度高，且不需要特殊的仪器设备，可用于非洲猪瘟病毒的抗体检测。
[0006]本专利技术获得了具有较好反应原性及免疫原性的可溶性p54蛋白，以该蛋白免疫BALB/c小鼠，通过细胞融合和亚克隆筛选，获得了一株特异性单抗；分析抗体序列，构建并表达p54特异性单抗，以避免抗体生产过程中，杂交瘤细胞抗体分泌不稳定以及腹水制备批次间存在差异的问题，能够保证抗体供应高效、稳定；研发出基于抗非洲猪瘟病毒p54蛋白特异性单克隆抗体的阻断ELISA抗体检测方法，解决了间接ELISA方法特异性较差的问题，使得该试剂盒具有很好的敏感性和特异性。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种敏感性高、特异性强、能够快速、简便地检测非洲猪瘟病毒p54抗体的阻断ELISA试剂盒。
[0008]该试剂盒的优点之一是使用了辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗非洲猪瘟病毒p54蛋白的单克隆抗体，提高了检测的敏感性和特异性。
[0009]基于上述目的，本专利技术的非洲猪瘟病毒p54阻断ELISA抗体检测试剂盒，包括以非
洲猪瘟病毒p54蛋白为包被抗原的的酶联反应板和酶标抗体；所述酶标抗体为与非洲猪瘟病毒p54蛋白特异性结合的单克隆抗体(1H6)制成的酶标抗体。
[0010]优选的，所述非洲猪瘟p54蛋白的序列为序列表中SEQ ID No.5序列，为密码子优化后序列，构建入原核表达载体pET
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28a，该蛋白为利用大肠杆菌原核表达系统获得的可溶性p54纯化蛋白，具有良好的特异性、敏感性及免疫原性。
[0011]优选的，与非洲猪瘟病毒p54蛋白特异性结合的单克隆抗体含有重链可变区1H6
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V
H
和轻链可变区1H6
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V
L
；所述重链可变区1H6
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V
H
和轻链可变区1H6
‑
V
L
均由决定簇互补区和框架区组成；所述1H6
‑
V
H
和所述1H6
‑
V
L
的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述1H6
‑
V
H
的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第31～37位氨基酸所示；所述1H6
‑
V
H
的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第52～70位氨基酸所示；所述1H6
‑
V
H
的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第103～109位氨基酸所示；所述1H6
‑
V
L
的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第24～38位氨基酸所示；所述1H6
‑
V
L
的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第54～60位氨基酸所示；所述1H6
‑
V
L
的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第93～102位氨基酸所示。
[0012]优选的，所述1H6
‑
V
H
的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1的第1～120位所示；其1H6
‑
V
L
的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2的第1～112位所示。
[0013]所述酶标抗体优选为经辣根化物酶标记抗体，所述辣根过氧化物酶可通过戊二醛法或过碘酸法交联在抗体上。
[0014]所述酶联反应板的最佳包被制备方法及条件是将所述非洲猪瘟病毒p54蛋白溶于100μl的pH 9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔0.1μg～1μg非洲猪瘟病毒p54蛋白，2～8℃下放置8～12小时，使包被抗原与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有10mg/ml牛血清白蛋白pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后4℃密封保存。
[0015]优选的，所述试剂盒还包括阳性对照血清和阴性对照血清，所述阳性对照血清为用p54重组蛋白免疫后的猪血清；所述阴性对照血清为无特定病原体的猪血清。
[0016]更进一步的，所述试剂盒还包括样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、底物液A、底物液B、终止液。所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板。所述样品稀释液为含有5mg/ml酪蛋白的0.01M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。所述20倍浓缩洗涤液为含有浓度为0.8％～1.2％(ml/ml)的Tween
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20的0.01M，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。所述底物液A为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液，所述底物液B为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液，使用时两者以1:1的比例混合。所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
[0017]本专利技术还要求保护单克隆抗体，其可与非洲猪瘟病毒特异性结合，是下述任意一项所述的单克隆抗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非洲猪瘟病毒p54阻断ELISA抗体检测试剂盒，包括酶联反应板和酶标抗体；其中，所述酶联反应板包被有非洲猪瘟病毒p54蛋白，酶标抗体为用酶标记的与非洲猪瘟病毒p54蛋白特异性结合的单克隆抗体。2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒p54阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述非洲猪瘟病毒p54蛋白的序列为序列表中SEQ ID No.5序列。3.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒p54阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：与非洲猪瘟病毒p54蛋白特异性结合的单克隆抗体含有重链可变区1H6
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V
H
和轻链可变区1H6
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L
；所述重链可变区1H6
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H
和轻链可变区1H6
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L
均由决定簇互补区和框架区组成；所述1H6
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和所述1H6
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L
的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述1H6
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H
的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第31～37位氨基酸所示；所述1H6
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H
的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第52～70位氨基酸所示；所述1H6
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V
H
的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第103～109位氨基酸所示；所述1H6
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L
的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第24～38位氨基酸所示；所述1H6
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V
L
的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第54～60位氨基酸所示；所述1H6
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V
L
的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第93～102位氨基酸所示。4.根据权利要求3所述的非洲猪瘟病毒p54阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述1H6
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V
H
的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1的第1～120位所示；其1H6
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V
L
的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2的第1～112位所示。5.根据权利要求1
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4中任意一项所述的非洲猪瘟病毒p54阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述酶联反应板的获得方法是将所述非洲猪瘟病毒p54蛋白溶于100μl的pH 9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔0.1μg～1μg非洲猪瘟病毒p54蛋白，2～8℃下放置8～12小时，使包被抗原与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有10mg/ml牛血清白蛋白pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后4℃密封保存。6.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒p54阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括底物液A、底物液B和终止液；所述底物液A为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液，所述底物液B为0.2mg/ml的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李鹏宇，张蕾，董春娜，李静，于之清，宗树成，王飞，刘新月，栗利芳，肖进，齐鹏，
申请(专利权)人：中牧实业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：