检测新型冠状病毒中和抗体的高灵敏度半定量试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及中和抗体检测技术领域，尤其是一种检测新型冠状病毒中和抗体的高灵敏度半定量试剂盒，包括检测卡、样品稀释液和比色卡，所述检测卡内设有金垫，所述金垫上含有胶体金标记的重组S

【技术实现步骤摘要】
检测新型冠状病毒中和抗体的高灵敏度半定量试剂盒


[0001]本专利技术涉及中和抗体检测
，具体领域为一种检测新型冠状病毒中和抗体的半定量试剂盒。

技术介绍

[0002]为了预防新的严重传染病，中和抗体疗法是一种有效预防和治疗的重要策略。病毒入侵人体后，靶细胞通过与病毒表面的刺突蛋白结合而被入侵。中和抗体是适应性免疫反应细胞分泌的一种可溶性蛋白，可以识别病毒表面蛋白并阻止其与细胞受体结合。
[0003]随着新型冠状病毒肺炎(COVID
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19)的全球大流行，感染和死亡人数继续上升，并且来自各个国家的科学家一直在寻找针对COVID
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19的治疗方法。中和抗体是一种针对新型冠状病毒蛋白的受体结合结构域(S
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RBD)的免疫球蛋白。中和抗体可以通过与新型冠状病毒表面蛋白的结合，抑制其与人细胞表面特异性受体ACE
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2的结合，从而阻断病毒的入侵。因此，预期中和抗体将成为对抗新型冠状病毒疾病的有效手段，而中和抗体检测能够用于监测接种新型冠状病毒疫苗的受试者或感染新型冠状病毒的人群中中和抗体的存在与否以及中和抗体浓度的高低，并能够用于评估疫苗接种效果。
[0004]病毒中和试验是最传统的中和抗体检测方法，但需要有细胞培养设施以及使用活病毒的试验条件，试验结果至少需要2～3天，风险高、安全性较低。
[0005]目前，市场上新冠病毒中和抗体的检测主要是采用竞争结合原理，血液中的中和抗体通过和新冠病毒的RBD蛋白竞争性与人细胞表面特异性受体ACE
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2的结合来检测。一般采用的技术方法包括酶联免疫法、化学发光法和胶体金法三种方法。其中，化学发光法和酶联免疫法能够定量、灵敏度高、通量高，但需要熟练的实验室人员进行操作，并且需要昂贵的检测设备。普通胶体金法具有检测速度快、不需要依赖检测设备的优点，但也有灵敏度较低、不能够定量的缺点。
[0006]在中和抗体检测中采用的竞争性胶体金免疫层析技术，通过中和抗体抑制新型冠状病毒表面蛋白的RBD蛋白与ACE2蛋白的竞争性结合，从而达到检测血清或血浆中中和抗体的浓度。新型冠状病毒中和抗体测试盒的测试区(T线)标有重组ACE
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2，对照线(C线)标有抗RBD的多克隆抗体。在检测过程中，将样品滴入样品孔中，新型冠状病毒的中和抗体与用胶体金标记的新型冠状病毒的重组S
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RBD抗原结合，从而阻止了胶体金标记的重组S
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RBD抗原与T线上的ACE
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2结合。绵羊抗S
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RBD多克隆抗体/新型冠状病毒重组S
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RBD抗原
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胶体金复合物形成于C线。检测后，根据比色卡，可以实现血液样品中新型冠状病毒中和抗体的半定量检测。
[0007]但是，目前的竞争法免疫层析技术检测中和抗体的试剂盒仍存在以下不足，如灵敏度较低，最低仅能检测出200ng/ml以上浓度的中和抗体；难以定量，只能定性检测出样品中是否存在中和抗体。
[0008]因此，开发一种用于检测新型冠状病毒中和抗体的高灵敏度半定量试剂盒成为了目前亟需解决的技术难题之一。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的在于提供一种检测新型冠状病毒中和抗体的高灵敏度半定量试剂盒，利用胶体金免疫层析技术进行改进，优化了RBD胶体金量、纳米金颗粒大小、RBD蛋白量与ACE2蛋白量的比例以及优化显色的呈现方式，以达到提高竞争法免疫层析技术检测中和抗体灵敏度的目的。
[0010]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0011]一种检测新型冠状病毒中和抗体的高灵敏度半定量试剂盒，包括检测卡、样品稀释液和比色卡，所述检测卡内设有金垫，所述金垫上含胶体金标记的重组S
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RBD抗原；其中，每mL胶体金所使用的重组S
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RBD抗原的量为5μg以上.
[0012]进一步的，所述胶体金的颗粒大小为20
‑
60nm。
[0013]进一步的，所述金垫包括玻璃纤维膜，所述玻璃纤维膜上喷有含胶体金标记的重组S
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RBD抗原，即RBD胶体金复合物，其喷量为0.5
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3.0μL/cm。
[0014]进一步的，所述检测卡内还设有NC膜，所述NC膜上设有检测线，所述检测线上包被有重组ACE
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2蛋白，所述重组ACE
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2蛋白的浓度为0.5
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5.0mg/mL。
[0015]进一步的，所述重组ACE
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2蛋白以点阵形式固定在NC膜上。
[0016]其中，检测卡的制备方法包括包被硝酸纤维素膜的制备、金垫的制备和检测卡制备；
[0017]所述包被硝酸纤维素膜的制备过程具体为：
[0018]在硝酸纤维素膜上包被质控线和检测线，在所述检测线上包被重组ACE
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2蛋白，所述重组ACE
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2蛋白使用量为0.5
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5.0mg/mL；采用点阵形式将重组ACE
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2蛋白固定在硝酸纤维素膜上；然后将包被硝酸纤维素膜于30℃烘箱中烘干备用。
[0019]其中，所述金垫的制备过程具体为：
[0020](1)制备胶体金
[0021]A.100ml蒸馏水中加入万分之二终浓度的氯金酸，在磁力搅拌器上加热搅拌煮沸；
[0022]B.在溶液中加入万分之三终浓度的柠檬酸三钠，继续加热搅拌10分钟；
[0023]C.室温冷却即获得胶体金；所述胶体金的颗粒大小为20
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60nm；
[0024](2)制备RBD胶体金复合物
[0025]A.取胶体金到离心管中，加入50μl的1％K2CO3，混匀；
[0026]B.加入重组S
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RBD抗原到离心管中，混匀，室温孵育30分钟；每mL胶体金所使用的重组S
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RBD抗原的量为5μg以上；
[0027](3)制备胶体金条
[0028]将玻璃纤维膜使用金垫处理液处理烘干，金垫处理液配方为：80g蔗糖，2.42g Tris，10g BSA，4g Tween
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20溶解于1L蒸馏水，pH＝8.0；使用喷金仪将RBD胶体金复合物浓缩十倍后以0.5
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3.0μL/cm的喷量处理30cm*1cm的玻璃纤维膜。
[0029]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0030]本专利技术在原有的竞争法免疫层析技术基础上进行了创新性的改进，大大提高了检测新冠中和抗体的灵敏度，在肉眼直接观察的情况下，最低可检测出20ng/ml浓度的中和抗体。本专利技术的试剂盒对于快速判断接种新型冠状病毒疫苗的受试者或感染新型冠状病毒的人群中中和抗体的存在与否，以及评估疫苗接种效果具有较高的参考价值，适于推广应用。
[0031本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测新型冠状病毒中和抗体的高灵敏度半定量试剂盒，包括检测卡、样品稀释液和比色卡，其特征在于：所述检测卡内设有金垫，所述金垫上含胶体金标记的重组S
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RBD抗原；其中，每mL胶体金所使用的重组S
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RBD抗原的量为5μg以上。2.根据权利要求1所述的检测新型冠状病毒中和抗体的高灵敏度半定量试剂盒，其特征在于：所述胶体金的颗粒大小为20
‑
60nm。3.根据权利要求1所述的检测新型冠状病毒中和抗体的高灵敏度半定量试剂盒，其特征在于：所述金垫包括玻璃纤维膜，所述玻璃纤维膜上喷有含胶体金标记的重组S
‑
RBD抗原，即RBD胶体金复合物，其喷量为0.5
‑
3.0μL/cm。4.根据权利要求1所述的检测新型冠状病毒中和抗体的高灵敏度半定量试剂盒，其特征在于：所述检测卡内还设有NC膜，所述NC膜上设有检测线，所述检测线上包被有重组ACE
‑
2蛋白，所述重组ACE
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2蛋白使用量为0.5
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5.0mg/mL。5.根据权利要求4所述的检测新型冠状病毒中和抗体的高灵敏度半定量试剂盒，其特征在于：所述重组ACE
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2蛋白以点阵形式固定在NC膜上。6.权利要求1
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5所述的检测新型冠状病毒中和抗体的高灵敏度半定量试剂盒，其特征在于：其中，检测卡的制备方法包括包被硝酸纤维素膜的制备、金垫的制备和检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：糜军，
申请(专利权)人：上海帛萘娅生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：