一种新型冠状病毒高亲和力中和抗体检测试剂盒及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种新型冠状病毒高亲和力中和抗体检测试剂盒及其制备方法与应用。包括高敏结合蛋白、重组RBD蛋白酶结合物、样品稀释液、微孔板、阳性对照、阴性对照、酶结合物稀释液、20

【技术实现步骤摘要】
一种新型冠状病毒高亲和力中和抗体检测试剂盒及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及一种新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2)中和抗体的检测，尤其涉及一种新型冠状病毒高亲和力中和抗体检测试剂盒及其制备方法与应用，属于临床检验


技术介绍

[0002]接种新冠病毒疫苗是防控疫情最经济、最有效的手段，也是全球各国预防控制新冠肺炎感染和传播采取的最主要的措施之一。我国自2020年12月15日启动大规模人群接种工作，灭活疫苗、腺病毒载体疫苗、重组亚单位疫苗等不同技术路线疫苗先后在国内紧急使用或附条件批准上市，截至2021年7月28日，31个省(自治区、直辖市)和新疆生产建设兵团累计报告接种新冠病毒疫苗160124.9万剂次。为全面维护人民群众生命健康安全发挥了重要作用。
[0003]中和抗体是由病毒入侵机体后产生的一类能与病毒结合并使之丧失感染力的抗体，是具有保护作用的抗体，与传统的临床上检测的IgM、IgG、IgA抗体在功能上有着较大的不同，是疫苗研发和临床评价过程中重要的指标之一，中和抗体检测的实验室金标准是感染抑制试验，主要包括蚀斑减少中和试验和微量中和试验。这两种方法均使用定量的活病毒与不同稀释度的等量血清混合后，接种预先准备好的单层细胞，通过不同的指标评价细胞的病变程度评价中和抗体效价。采用体外培养的活病毒进行的中和试验反映的是人体血液样本中能够阻断病毒感染的总中和抗体的效价。这两种实验均需使用活的新冠病毒需要在生物安全三级实验室内完成，但该类方法操作技术难度大，耗时较长，生物安全的要求高，不适合普通接种疫苗人群高通量筛查。
[0004]中国医科院病原微生物研究所在Nature Communication上发表研究论文，利用假病毒系统证明了SARS
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CoV
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S蛋白在病毒入侵细胞时表现出的特征，并对其与SARS
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CoV产生的免疫交叉反应进行了阐述。该研究使用慢病毒SARS
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S假病毒系统，确定了Huh7、Vero81、LLCMK2、Calu3等细胞对于该系统易感，文中还详细论述了病毒与受体ACE2结合进入细胞的途径。新型冠状病毒S蛋白是病毒毒力的关键因子，识别新冠病毒的S(刺突)蛋白上的RBD区(受体结合域)的中和抗体，就可以阻断新冠病毒和人细胞上的ACE2受体结合，使得新冠病毒无法感染人细胞，是决定病毒毒力、组织嗜性和宿主范围的关键部分，也是中和抗体和疫苗设计的主要靶标。
[0005]通常伴随着疫苗的研究和上市，国内外研究机构和生产企业致力于采用体外诊断试剂进行中和抗体检测的研究，用于评价疫苗的有效性，主要通过建立的体外诊断试剂与体外培养活病毒的中和试验进行对比研究，从而建立一个有效的Cut
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off值，确立体外诊断试剂检测中和抗体的性能，并通过确定适合的判断界值，建立与病毒保护力之间的相关性，确定最低保护水平。例如已经较为成熟的流感疫苗、EV71疫苗、狂犬病疫苗、脊髓灰质炎疫苗等，均已建立了WHO认可的标准化的中和抗体试验，有相应的WHO标准品和推荐使用的标准毒株，并设定了明确的判断界值。针对新冠病毒疫苗，最直接的检测方法为新冠中和抗体
的检测，一般是基于单抗原表位或多抗原表位采用竞争抑制原理的酶联免疫法进行中和抗体检测，但是检测速度较慢。
[0006]有鉴于此，急需提供一种新型冠状病毒高亲和力中和抗体检测试剂盒及其制备方法。

技术实现思路

[0007]针对现有技术不足，本专利技术提供了一种新型冠状病毒高亲和力中和抗体检测试剂盒及其制备方法与应用。
[0008]术语说明：
[0009]BSA：牛血清白蛋白。
[0010]本专利技术的技术方案如下：
[0011]一种新型冠状病毒高亲和力中和抗体检测试剂盒，包括高敏结合蛋白、重组RBD蛋白酶结合物和样品稀释液；
[0012]所述高敏结合蛋白制备方法为利用灭活的新型冠状病毒感染者血清经过装有重组RBD中和抗体偶联的琼脂糖微球层析柱过滤，高敏结合蛋白会结合到琼脂糖微球上，经过洗杂、洗脱得到纯化的高敏结合蛋白；
[0013]所述重组RBD蛋白酶结合物是辣根过氧化物酶标记的重组RBD蛋白；该酶标RBD酶结合物工作效价为1:9000；所述重组RBD蛋白是利用CHO细胞表达的新型冠状病毒SARS
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CoV
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2RBD三聚体的重组蛋白；
[0014]所述样品稀释液的配方是：除菌的1000mL纯水中，含NaCl 8g、NaH2PO4·
2H2O 0.2g、Na2HPO4·
12H2O 2.9g、CTAB 1g、BSA 5g、TritonX
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100 0.1mL、Proclin300 1mL，pH 7.4。
[0015]根据本专利技术优选的，所述新型冠状病毒高亲和力中和抗体检测试剂盒还包括：微孔板、作为阳性对照的RBD中和抗体标准品溶液、作为阴性对照的正常人新冠病毒SARS
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2抗体阴性血清、酶结合物稀释液、20
×
浓缩洗涤液、显示液A、显示液B和终止液。
[0016]进一步优选的，所述微孔板为96或48孔的聚苯乙烯微孔板，且其各孔包被有浓度为5
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10μg/mL的高敏结合蛋白。
[0017]进一步优选的，所述RBD中和抗体标准品溶液为：样品稀释液稀释的浓度为1μg/mL的RBD中和抗体溶液；所述的RBD中和抗体是用来自于测定的新冠康复患者中和抗体可变区序列并与人源化Fc融合，通过CHO细胞重组表达形成得到。
[0018]进一步优选的，所述酶结合物稀释液的配方是：除菌的1000mL纯水中，含NaCl 8g、NaH2PO4·
2H2O 0.2g、Na2HPO4·
12H2O 2.9g、BSA 5g、Proclin300 1mL。
[0019]进一步优选的，所述20
×
浓缩洗涤液的配方是：除菌的50mL双蒸水中，含NaCl 8.0g、NaH2PO4·
2H2O 0.2g、Na2HPO4·
12H
2 O 2.9g、吐温20 0.5mL；
[0020]进一步优选的，所述显示液A是浓度为0.3mg/mL的四甲基联苯胺(TMB)溶液；所述显示液B是浓度为0.74mg/mL的过氧化脲溶液；使用时将显示液A与显示液B按体积比1﹕1混合；
[0021]进一步优选的，所述终止液是浓度为2mol/L的硫酸溶液。
[0022]本专利技术中的新型冠状病毒高亲和力中和抗体检测试剂盒还包括盒体、封板膜、密
封袋和说明书。
[0023]一种上述新型冠状病毒高亲和力中和抗体检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
[0024]1)酶标板的制备：
[0025]1.1)配制包被液：即配制本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新型冠状病毒高亲和力中和抗体检测试剂盒，其特征在于，包括：高敏结合蛋白、重组RBD蛋白酶结合物和样品稀释液；所述高敏结合蛋白制备方法为利用灭活的新型冠状病毒感染者血清经过装有重组RBD中和抗体偶联的琼脂糖微球层析柱过滤，高敏结合蛋白会结合到琼脂糖微球上，经过洗杂、洗脱后，得到纯化的高敏结合蛋白；所述重组RBD蛋白酶结合物为辣根过氧化物酶标记的重组RBD蛋白；该酶标RBD酶结合物工作效价为1:9000；所述重组RBD蛋白是利用CHO细胞表达的新型冠状病毒SARS
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CoV
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2RBD三聚体的重组蛋白；所述样品稀释液的配方是：除菌的1000mL纯水中，含NaCl 8g、NaH2PO4·
2H2O 0.2g、Na2HPO4·
12H2O 2.9g、CTAB 1g、BSA 5g、TritonX
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100 0.1mL、Proclin300 1mL，pH 7.4。2.如权利要求1所述的新型冠状病毒高亲和力中和抗体检测试剂盒，其特征在于，所述新型冠状病毒高亲和力中和抗体检测试剂盒还包括：微孔板、作为阳性对照的RBD中和抗体标准品溶液、作为阴性对照的正常人新冠病毒SARS
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CoV
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2抗体阴性血清、酶结合物稀释液、20
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浓缩洗涤液、显示液A、显示液B和终止液。3.如权利要求2所述的新型冠状病毒高亲和力中和抗体检测试剂盒，其特征在于，所述微孔板为96或48孔的聚苯乙烯微孔板，且其各孔包被有浓度为5
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10μg/mL的高敏结合蛋白。4.如权利要求2所述的新型冠状病毒高亲和力中和抗体检测试剂盒，其特征在于，所述RBD中和抗体标准品溶液为：样品稀释液稀释的浓度为1μg/mL的RBD中和抗体溶液。5.如权利要求2所述的新型冠状病毒高亲和力中和抗体检测试剂盒，其特征在于，所所述酶结合物稀释液的配方是：除菌的1000mL纯水中，含NaCl 8g、NaH2PO4·
2H2O 0.2g、Na2HPO4·
12H2O 2.9g、BSA 5g、Proclin300 1mL。6.如权利要求2所述的新型冠状病毒高亲和力中和抗体检测试剂盒，其特征在于，所述20
×
浓缩洗涤液的配方是：除菌的50mL双蒸水中，含NaCl 8.0g、NaH2PO4·
2H2O 0.2g、Na2HPO4·
12H
2 O 2.9g、吐温20 0.5mL。7.如权利要求2所述的新型冠状病毒高亲和力中和抗体检测试剂盒，其特征在于，所述显示液A是浓度为0.3mg/mL的四甲基联苯胺(TMB)溶液；所述显示液B是浓度为0.74mg/mL的过氧化脲溶液；使用时将显示液A与显示液B按体积比1﹕1混合；优选的，所述终止液是浓度为2mol/L的硫酸溶液。8.一种权利要求1所述的新型冠状病毒高亲和力中和抗体检测试剂盒，其特征在于，包括如下步骤：1)酶标板的制备：1.1)配制包被液：即配制碳酸盐缓冲溶液，并调整pH值为9.6，包被液的配方是：Na2CO31.59gNaHCO32.94g纯化水定容至1000mL配制完成后过滤除菌，4℃保存；1.2)配制洗涤液，洗涤液的配方是：NaCl8.0gNaH2PO4·
2H2O0.2g
Na2HPO4·
12H2O2.9g吐温200.5mL纯化水定容至1000mL配制完成后过滤除菌，4℃保存；1.3)配制封闭液，封闭液的配方是：NaCl8.0gNaH2PO4·
2H2O0.2gNa...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜晓林，寇增强，马吉祥，
申请(专利权)人：山东省疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：