一种黄山松的组培快繁方法技术

本发明专利技术提供了一种黄山松的组培快繁方法，方法如下：获取黄山松种子；并去除其外种皮；采用75％酒精与1％次氯酸钠溶液进行组合消毒；随后，吸干水分，挑出种子胚；将外植体接种于愈伤组织诱导培养基进行愈伤组织诱导；挑选愈伤组织转接至不定芽诱导培养基进行不定芽诱导；将不定芽转接至伸长培养基进行不定芽伸长培养；选择高度为1～2cm的黄山松不定芽，并在去除其芽基部的针叶后，将其转接至生根培养基中进行直接生根培养。本发明专利技术的优点在于：首次以黄山松种子的种胚为实验材料，建立了黄山松组培快繁技术；且操作简单、培育成本低、繁殖效率高、受自然环境影响小，有很好的市场及产业化应用前景。应用前景。应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种黄山松的组培快繁方法


[0001]本专利技术涉及植物组织培养
，尤其涉及一种黄山松的组培快繁方法。

技术介绍

[0002]黄山松是中国特有针叶树种，是我国东部亚热带高海拔地区山地绿化、造林和生态恢复的重要树种。黄山松具有较强的生态演替功能、极强的适应性、较高的生态环保功能以及独特的自然景观效果。松树是松材线虫的危害寄主，而松材线虫病传入我国以来，截止2020年12月31日，已蔓延至全国18个省(自治区、直辖市)726个县级行政区，严重威胁我国生态安全、生物安全和经济发展。黄山松是松材线虫病的寄主之一，并于2004年在安庆大龙山林场近700m高的海拔林地中首次发现了自然状态下松材线虫侵染黄山松，并造成数株黄山松枯死，这对黄山景区内黄山松种质资源造成巨大威胁。然而，目前关于黄山松种质资源保存与组培快繁体系的研究还未见报道。
[0003]植物组织培养是植物种质资源保存的重要方式。植物组织培养具有生长周期短、繁殖率高、管理方便等诸多优点，有利于工厂化生产和自动化控制。利用植物组织培养技术，不仅可以在短时间内快速繁殖珍稀濒危植物，使珍稀物种得以保存。同时，该技术可以快速繁殖名优特新品种，获取具有母本优良性状的植株。
[0004]据此，若能以黄山松种子的种胚为外植体开展黄山松组培快繁技术，将对黄山松种质资源保存、遗传改良、新品种培育和优质种苗繁殖等方面具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种黄山松的组培快繁方法，其操作简单、培育成本低、繁殖效率高，且受自然环境影响小，有很好的市场及产业化应用前景。
[0006]本专利技术采用以下技术方案解决上述技术问题：
[0007]一种黄山松的组培快繁方法，包括如下步骤：
[0008](1)外植体的预处理：
[0009]将黄山松球果置于自然光照下晾晒，以获取黄山松种子；接着，去除黄山松种子的外种皮；
[0010](2)外植体的消毒：
[0011]将去除外种皮的黄山松种子，采用75％酒精与1％次氯酸钠溶液进行组合消毒；随后，在无菌滤纸上吸干水分，并挑出种子胚，即得接种所需的无菌外植体；
[0012](3)愈伤组织诱导：
[0013]无菌条件下，将步骤(2)获得的无菌外植体接种于愈伤组织诱导培养基上，进行愈伤组织的诱导；其中，愈伤组织诱导培养基的配方为：MS+30g/L蔗糖 +7g/L琼脂粉+1mg/L 6
‑
BA+0.2mg/L NAA，pH 5.8；
[0014](4)不定芽的诱导与伸长：
[0015]挑选愈伤组织，将其转接至不定芽诱导培养基，进行不定芽的诱导；其中，不定芽
诱导培养基的配方为：DCR+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉+1mg/L 6
‑
BA+0.05mg/L NAA，pH 5.8；
[0016]待长出不定芽，将诱导的不定芽转接至伸长培养基，进行不定芽的伸长培养；其中，伸长培养基的配方为：DCR+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉+0.1mg/L 6
‑
BA+0.05mg/L NAA，pH 5.8；
[0017](5)生根培养：
[0018]选择高度为1～2cm的黄山松不定芽，并在去除其芽基部的针叶后，将其转接至生根培养基中进行直接生根培养；其中，生根培养基的配方为：1/2 DCR+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉+2mg/L IBA+0.05mg/L NAA，pH 5.8。
[0019]作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(1)中，黄山松球果采自安徽黄山风景区。
[0020]作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(2)中，采用75％酒精与1％次氯酸钠溶液进行组合消毒的具体过程为：将去除种皮的黄山松种子取出备用；接着，在超净工作台中，先用无菌水清洗种子3～5次，再利用75％酒精漂洗60s，利用1％次氯酸钠溶液浸泡10min，最后再用无菌水冲洗3～5次。
[0021]作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(2)中，采用75％酒精与1％次氯酸钠溶液进行组合消毒方式，种子的污染率为2％。
[0022]作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(3)中，诱导培养至12～16d时，外植体开始愈伤化，出愈率93.65％～96.35％。
[0023]作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(4)中，诱导培养至25～35d时，愈伤组织开始长出不定芽，平均不定芽数为2.42～3.72。
[0024]作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(5)中，生根培养35～45d时，开始生根，生根率28％。
[0025]作为本专利技术的优选方式之一，所述MS、DCR与1/2DCR基本培养基均为本领域常规培养基。
[0026]作为本专利技术的优选方式之一，所述愈伤组织诱导、不定芽的诱导与伸长，以及，生根培养的过程中，培养条件均为：培养温度25
±
2℃，相对湿度70％～80％，光照时间14～16h/d，光照强度2000～2500Lx。
[0027]作为本专利技术的优选方式之一，还包括步骤(6)的炼苗移栽步骤；所述炼苗移栽过程如下：
[0028]待黄山松生根苗长出发达根系后，打开组培苗瓶盖，炼苗3～5天，期间保持培养基中水分充足；随后，将组培瓶中的培养基用玻璃棒捣碎，并将组培苗从组培瓶中取出；接着，用自来水将其根部培养基冲洗干净，并移栽至花盆中；最后，将移栽的黄山松苗置于培养室中进行培养。
[0029]本专利技术相比现有技术的优点在于：
[0030](1)本专利技术首次以黄山松种子的种胚为实验材料，进行黄山种胚消毒体系的构建以及愈伤、不定芽、生根的诱导试验，最终建立了黄山松组培快繁技术；其操作简单、培育成本低、繁殖效率高，且受自然环境影响小，有很好的市场及产业化应用前景；
[0031](2)本专利技术填补了关于黄山松离体快繁殖技术的空白，解决了黄山松无性繁殖难、种苗成活率低的瓶颈，极大地减少了购买种苗的成本，降低了因种子质量参差不齐而导致的造林效果差等风险，实现了黄山松的规模化种植，增加了林农收益。
附图说明
[0032]图1是实施例3中去除外种皮的黄山松种子图；
[0033]图2是实施例3中无菌种子胚转接至诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养的培养图；
[0034]图3是实施例3中外植体诱导出的愈伤组织状态图；
[0035]图4是实施例3中愈伤组织转接至不定芽诱导培养基中进行不定芽诱导培养的培养图；
[0036]图5是实施例3中愈伤组织长出的不定芽状态图；
[0037]图6是实施例3中不定芽转接至伸长培养基进行不定芽伸长培养的培养图；
[0038]图7是实施例3中不定芽的生根图；
[0039]图8是实施例3中组培苗的开盖炼苗图；
[0040]图9是实施例3中生根苗移栽至花盆后的状态图；
[0041]图10是实施例4中不同消毒组合对黄山松种子胚的消毒效果图；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种黄山松的组培快繁方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)外植体的预处理：将黄山松球果置于自然光照下晾晒，以获取黄山松种子；接着，去除黄山松种子的外种皮；(2)外植体的消毒：将去除外种皮的黄山松种子，采用75％酒精与1％次氯酸钠溶液进行组合消毒；随后，在无菌滤纸上吸干水分，并挑出种子胚，即得接种所需的无菌外植体；(3)愈伤组织诱导：无菌条件下，将步骤(2)获得的无菌外植体接种于愈伤组织诱导培养基上，进行愈伤组织的诱导；其中，愈伤组织诱导培养基的配方为：MS+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉+1mg/L 6
‑
BA+0.2mg/L NAA，pH 5.8；(4)不定芽的诱导与伸长：挑选愈伤组织，将其转接至不定芽诱导培养基，进行不定芽的诱导；其中，不定芽诱导培养基的配方为：DCR+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉+1mg/L 6
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BA+0.05mg/L NAA，pH 5.8；待长出不定芽，将诱导的不定芽转接至伸长培养基，进行不定芽的伸长培养；其中，伸长培养基的配方为：DCR+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉+0.1mg/L 6
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BA+0.05mg/L NAA，pH 5.8；(5)生根培养：选择高度为1～2cm的黄山松不定芽，并在去除其芽基部的针叶后，将其转接至生根培养基中进行直接生根培养；其中，生根培养基的配方为：1/2DCR+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉+2mg/L IBA+0.05mg/L NAA，pH 5.8。2.根据权利要求1所述的黄山松的组培快繁方法，其特征在于，所述步骤(1)中，黄山松球果采自安徽黄山风景区。3.根据权利要求1所述的黄山松的组培快繁方法，其特征在于，所述步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：项艳，兰延钢，汤明霞，许成芳，王瑞佳，严涵薇，吴敏，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：