一种以子叶节为外植体的柠条锦鸡儿离体再生方法技术

本发明专利技术公开一种以子叶节为外植体的柠条锦鸡儿高效再生方法。利用子叶节为起始外植体，通过直接器官发生途径建立一种快速有效的再生体系，不经由愈伤组织的诱导及分化，简化了培养流程，在短时间内便可获得柠条锦鸡儿再生植株，此种方法培养的组培苗植株表型一致性高，稳定地保持母体的优良特性。通过建立以子叶节为起始外植体的离体再生体系，为柠条锦鸡儿快繁体系、遗传转化体系的扩大和发展提供有力的技术保障，进而可以顺利开展以柠条为代表的转基因育种工作。的转基因育种工作。

【技术实现步骤摘要】
一种以子叶节为外植体的柠条锦鸡儿离体再生方法


[0001]本专利技术涉及一种植物再生和快速繁殖
，具体涉及柠条的再生方法。

技术介绍

[0002]柠条锦鸡儿(Caragana korshinskii Kom)属于豆科锦鸡儿属落叶灌木，广泛分布于我国干旱与半干旱地区，是一种重要的生态经济灌木，不仅具有防风固沙、保持水土的生态作用，还有薪炭材、饲用、制浆造板、药用等经济价值(汪阳东.中间锦鸡儿油酸脱氢酶基因(CaFAD2)克隆与功能鉴定[D].中国林业科学研究院,2007.)。长期在抵御逆境环境中生长，形成了适应恶劣环境的生存机制，具有极强的抗逆性(牛西午.柠条生物学特性研究[J].华北农学报，1998，13(4)：122
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129)，成为抗逆机制研究的明星物种。
[0003]目前，国外未见关于柠条锦鸡儿组织培养相关研究报道，国内虽对柠条锦鸡儿及同属植物组织培养方面的研究虽然已有一些，但缺少稳定高效的再生体系。高玫等以柠条上胚轴、下胚轴为外植体，诱导出不定芽，获得再生植株(高玫,李天然.几种野生豆科锦鸡儿属(Caragana Fabr.)植物离体培养过程中器官分化和内源植物激素含量的关系[J].内蒙古大学学报(自然科学版),1990(03):127
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137+162)；慈忠玲等对以柠条子叶和胚轴为外殖体诱导愈伤组织，愈伤组织可分化出胚性细胞团，但未分化出不定芽(慈忠铃.柠条锦鸡儿愈伤组织的培养和分化[J].内蒙古林学院学报,1998,20(12):15
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>19)；宋俊双等以柠条锦鸡儿无菌苗子叶和下胚轴为外植体，进行直接不定芽发生，成功诱导出不定芽，但是经由愈伤途径未能成功诱导出不定芽(宋俊双,王赞,孙桂芝,等.柠条锦鸡儿的组织培养[J].草地学报,2007,15(1):66
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66)；李光道等以柠条锦鸡儿嫩枝作为外植体，诱导出不定芽(李光道,白生才,张秀志,李军.柠条锦鸡儿组培研究[J].甘肃农业科技,2010(11):18
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20.)；邵玲玲以柠条锦鸡儿茎段为外植体，初步建立起一套快繁体(邵玲玲.柠条锦鸡儿组织培养技术[J].农业系统科学与综合研究(4):469
‑
474)。
[0004]总体来说，柠条离体再生仍处于尝试阶段，还没有找到有效的再生体系，这是一直需要克服的难题。因此，建立一个快速、高效、稳定的再生平台对柠条锦鸡儿开展转基因育种工作是十分重要的。

技术实现思路

[0005]为了解决上述瓶颈问题，本专利技术人克服现有技术不足，开展柠条锦鸡儿子叶节离体发生研究，最终获得柠条锦鸡儿子叶节离体再生体系。
[0006]本专利技术提供一种以子叶节为外植体的柠条锦鸡儿离体再生的方法，其包括如下步骤：
[0007](1)无菌苗的制备：将消毒的柠条锦鸡儿种子接种至MS培养基中进行培养。优选地，第(1)步骤的具体操作：挑选颗粒饱满、无虫眼、无黑色斑点的柠条锦鸡儿种子，消毒接种至MS培养基中。其中，消毒方式在超净台外用洗洁精清洗3min，75％回收酒精棉花包裹擦拭种子，进入超净台后再用75％回收酒精过一下后，再用75％酒精消毒2min，最后用10％次
氯酸钠消毒20min，无菌水清洗5～6次，将消毒干净的种子放在无菌滤纸上，吸干水分备用；
[0008](2)不定芽诱导培养
[0009]不定芽诱导发生有两种途径，第一种是将经由愈伤诱导出不定芽，耗时长、还有发生突变的可能；第二种是不经由愈伤组织诱导途径，外植体直接诱导出不定芽，这种途径增殖快，成苗迅速，可以稳定地保持母体的优良特性，因此以该途径为柠条锦鸡儿种苗繁育的主要途径。
[0010]选取(1)中培养10
‑
20d的无菌苗，用无菌刀片在子叶连接处向下2mm处平切，去除下胚轴区域及真叶部分，得到子叶节外植体。将子叶节接种至不定芽诱导培养基上，所述不定芽培养培养基以MS基础培养基，并添加6
‑
苄氨基嘌呤(BA)0.5
‑
6.0mg/L和萘乙酸(NAA)0.05
‑
0.60mg/L，优选地BA添加量为1.0
‑
4.0mg/L、NAA为0.10
‑
0.40mg/L，光下培养7
‑
25d，优选为10
‑
20d，最优选为14
‑
16d；优选地，植株不定芽诱导启动后，继代培养2次左右。
[0011](3)不定芽伸长培养
[0012]将步骤(2)中诱导出待要伸长的丛生芽，接种至不定芽伸长诱导培养基，所述不定芽伸长培养基以步骤(2)中MS培养基作为基础培养基，并添加0.1
‑
1mg/L 6
‑
BA与0.01
‑
0.10mg/L NAA；优选地BA添加量为0.3
‑
1.0mg/L、NAA为0.03
‑
0.1mg/L，培养25
‑
30d，发现丛芽有明显的伸长趋势，优选地，不需要转接继代培养，原培养基继续培养20
‑
25d，便可得到大量伸长的芽苗。
[0013]进一步地，所述方法还包括下述步骤，即(4)生根培养：将第(3)步继代培养伸长的丛芽分成单株，接种至生根培养基中，进行生根诱导。优选地，所述生根培养基MS培养基作为基础培养基，并添加NAA0.1
‑
1.5mg/L，优选为0.5
‑
1mg/L，于光下培养时间为30
‑
40d。
[0014]优选地，第(1)至(4)中采用的培养基中添加蔗糖30g/L，肌醇0.1g/L，琼脂粉5.5g/L，调节培养基pH值为5.8。培养条件为20
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25℃，光照强度2000
‑
3000lx，光照12h/d。
[0015]更进一步地，还包括下述步骤，即(5)炼苗：将第(4)步获得的已生根再生苗，挑选长势健壮的瓶苗进行炼苗。所述炼苗方法为：将培养瓶盖打开，注入0.5
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1cm清水，置于室温、自然光照下，静置2
‑
3天，将瓶苗掏出，将基部附着的培养基洗净，准备移栽。
[0016]再进一步地，还包括下述步骤，即(7)移栽：将炼苗后的再生苗进行移栽，优选地移栽基质为泥炭土：珍珠岩：蛭石＝3：1：1，移栽前将基质连盆浸入水中使其完全润湿，移栽后套袋保湿，湿度不够时使用喷壶喷洒植株表面，待苗生长强健后除去套袋，正常养护。
[0017]本专利技术基于柠条锦鸡儿组织培养现状，经研究发现利用柠条锦鸡儿的子叶节为外植体，通过培养基的选择，以及不同激素组合的选择，以及使用不同浓度及配比的激素组合，最终成功研究出通过直接器官发生途径建立一种高效稳定的再生体系。尤其以子叶节为外植体，不经由愈伤途径直接进行不定芽离体再生，无论是柠条还是锦鸡儿属其他物种还未见报道。本专利技术方法可以培养出表型一致性高本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种以子叶节为外植体的柠条锦鸡儿离体再生的方法，其包括如下步骤：(1)无菌苗的制备：将消毒的柠条锦鸡儿种子接种至MS培养基中进行培养；优选地，第(1)步骤的具体操作：挑选颗粒饱满、无虫眼、无黑色斑点的柠条锦鸡儿种子，消毒接种至MS培养基中；(2)不定芽诱导培养：选取(1)中培养10
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20d的无菌苗，用无菌刀片在子叶连接处向下2mm处平切，去除下胚轴区域及真叶部分，得到子叶节外植体；将子叶节接种至不定芽诱导培养基上，所述不定芽培养培养基以MS基础培养基，并添加6
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苄氨基嘌呤(BA)0.5
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6.0mg/L和萘乙酸(NAA)0.05
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0.60mg/L，优选地BA添加量为1.0
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4.0mg/L、NAA为0.10
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0.40mg/L，光下培养7
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25d，优选为10
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20d，最优选为14
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16d；优选地，植株不定芽诱导启动后，继代培养1
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3次；(3)不定芽伸长培养：将步骤(2)中诱导出待要伸长的丛生芽，接种至不定芽伸长诱导培养基，所述不定芽伸长培养基以步骤(2)中MS培养基做为基础培养基，并添加0.1
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1mg/L 6
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BA与0.01
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0.10mg/L NAA；优选地BA添加量为0.3
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1.0mg/L、NAA为0.03
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0.1mg/L，培养25
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30d，发现丛芽有明显的伸长趋势；优选地，不需要转接继代培养，原培养基中继续培养20
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【专利技术属性】
技术研发人员：李国婧，朱木兰，刘槟，齐力旺，王瑞刚，郑珂媛，
申请(专利权)人：内蒙古农业大学，
类型：发明
国别省市：