一种马尾松胚乳二倍体愈伤组织诱导与增殖的方法技术

本发明专利技术公开了一种马尾松胚乳二倍体愈伤组织诱导与增殖的方法，包括以下步骤：1）取成熟马尾松种子去壳后于4℃冰箱过夜；2）使用消毒剂对去壳马尾松种子进行一定时间的消毒处理和灭菌；3）配置愈伤组织诱导培养基，于高压灭菌锅灭菌；4）将消毒处理后的种子置于灭菌后培养皿，用滤纸吸干水分，纵切种子取出中间种胚，之后将胚乳接种于愈伤诱导培养基中进行暗培养；5）一个月后将胚乳愈伤组织转接继代，并转入光环境下培养；6）鉴定胚乳细胞染色体倍性；7）对二倍体愈伤组织进行增殖培养。本方法设计理想，通过对马尾松胚乳（单倍体）进行组织培养，诱导和增殖胚乳二倍体愈伤组织，为马尾松双单倍体植株培育与马尾松倍性育种奠定了基础。基础。

【技术实现步骤摘要】
一种马尾松胚乳二倍体愈伤组织诱导与增殖的方法


[0001]本专利技术涉及植物胚乳组织培养技术，具体的说是一种马尾松胚乳二倍体愈伤组织诱导与增殖的方法。

技术介绍

[0002]马尾松（Pinus massoniana Lamb.）是松科松属的常绿高大乔木，俗名青松、山松，是我国东部地区分布最广泛的针叶树种。分布于江苏、浙江、福建、广东、台湾等地区。马尾松的经济价值极高，浑身是宝。木材可供一般建筑和家具及火柴等用材；木质耐腐，造船、枕木、矿柱等用；木材纤维长，是比较好的新闻纸与水泥袋等包装纸原料；松树采割的松脂可提取松香和松节油，是工业部门不可缺少的原料。
[0003]马尾松的良种供应不足一直是影响马尾松人工林产业经济效益的瓶颈问题。扦插繁殖是一种较好的良种基因型扩繁方法，但马尾松优质插穗大量获取较难，同时插穗生根能力具有年龄效应，且受季节限制，增殖系数较低。而通过组织培养，建立马尾松良种快繁体系，能对少量的外植体进行大量的繁殖，能大量提供马尾松优质材料。马尾松的胚乳是由大孢子直接发育而成的，是单倍体，因此以胚乳为材料进行组织培养有望获得单倍体材料，通过单倍体育种具有快速纯合基因、缩短育种年限、提高育种效率等优势，本研究直接获得由胚乳单倍体细胞染色体加倍而形成的二倍体愈伤，可与多种育种技术相结合，加快育种研究。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了一种马尾松胚乳二倍体愈伤组织诱导与增殖的方法，其目的在于克服马尾松育种研究周期长的困难，为后续马尾松胚乳组织培养以及马尾松双单倍体育种奠定基础。<br/>[0005]本专利技术的技术方案如下：一种马尾松胚乳二倍体愈伤组织诱导与增殖的方法，包括以下步骤：a）取成熟马尾松种子，剥去种壳后置于4℃冰箱过夜；b）配置愈伤组织诱导培养基，加入培养基成分后溶于1L纯净水中，加热溶解调节ph值之后分装入组培瓶中，于121℃灭菌25min，冷却后取出备用。
[0006]c）在超净工作台中对去壳后的种子进行消毒灭菌，先使用酒精消毒，消毒后用无菌水冲洗3~5次，再使用NaClO消毒，之后无菌水冲洗3~5次。
[0007]d）将消毒后的种子用灭菌后的滤纸吸干表面水分，再纵切种胚取出，接种于配置好的愈伤组织诱导培养基中，置于25℃条件下暗培养2个月。
[0008]e）配置愈伤继代培养基，配置方式与步骤b)相同。
[0009]f）每隔一个月，将愈伤组织从诱导培养基中转接入继代培养基，转接时将愈伤组织切至黄豆大小，再转到光环境下培养。
[0010]g）对各次继代的愈伤组织进行染色体倍性鉴定，计算二倍体细胞的比例。
[0011]h）愈伤细胞染色体倍性稳定后，此时愈伤组织二倍体细胞比例高达86%，对愈伤组织进行增殖培养，将愈伤组织从继代培养基中转接入增殖培养基，转接时将愈伤组织切至黄豆大小。
[0012]优选地，所述步骤b)与e）中，培养基的成分配方为DCR+NAA2mg/L+6
‑
BA1mg/L，配置方式为称取DCR培养基、蔗糖以及琼脂混合后溶解，溶解后加入生长素NAA2mg/L与细胞分裂素6
‑
BA1mg/L，并定容至1L。
[0013]优选地，所述步骤c)中，酒精浓度为75%且消毒时间为30s，NaClO浓度为有效率浓度2%且消毒时间为15min。
[0014]优选地，所述步骤f）中，稳定倍性所需的转接次数为4次每次一个月，也就是4个月。
[0015]优选地，所述步骤h）中，培养基的成分配方为WPM+NAA0.05mg/L+MT0.5mg/L。配置方式为称取WPM培养基、蔗糖以及琼脂混合后溶解，溶解后加入生长素NAA0.05mg/L与细胞分裂素MT0.5mg/L，定容至1L。
[0016]优选地，所述愈伤诱导培养基和增殖培养基均加入蔗糖30g/L和琼脂7g/L，且ph值为5.5，其培养环境温度控制为25
±
1℃。
[0017]使用本专利技术所提供的一种马尾松胚乳二倍体愈伤组织诱导与增殖的方法，可以大量获取马尾松胚乳愈伤组织，为马尾松胚乳的组织培养研究，双单倍体育种等提供关键技术。
[0018]具体实施方式：下面对本专利技术进行进一步的说明，一种马尾松胚乳二倍体愈伤组织诱导与增殖的方法，其具体操作步骤如下：a)外植体预处理：将马尾松种子保存于4℃冰箱中，于接种前一天取出剥去种壳，并浸泡于无菌水中，再存放于4℃冰箱冷藏过夜。
[0019]b)诱导培养基的配置：配置愈伤组织诱导培养基，其配方为DCR+NAA2mg/L+6
‑
BA1mg/L，配置好后分装入瓶，使用高温高压灭菌锅对培养基以及操作工具进行灭菌，灭菌温度121℃，时间25min。之后取出放置于超净工作台中冷却备用。
[0020]c)外植体消毒处理：将剥去外壳的种子于超净工作台中进行表面杀菌处理，在75%酒精处理30s和2%NaClO处理15min，每次处理后均使用无菌水冲洗5~6次。将消毒好的种子放于无菌水中备用，接种时取出种子置于滤纸上吸干水分，然后切除胚芽再纵切去除胚，接种于诱导培养基中进行暗培养1个月。
[0021]f）每隔1月，将愈伤组织从诱导培养基中转接入继代培养基，转接时奖愈伤组织切至黄豆大小，再转到光环境下培养。
[0022]g) 对各次继代的愈伤组织进行染色体倍性鉴定。
[0023]e)配置愈伤增殖培养基：配置愈伤组织增殖培养基，其配方为：WPM+NAA0.05mg/L+MT0.5mg/L，配置好后分装入瓶，使用高温高压灭菌锅对培养基以及操作工具进行灭菌，灭菌温度121℃，时间25min。之后取出放置于超净工作台中冷却备用。
[0024]f)增殖培养：将愈伤组织从诱导培养基中转接入增殖培养基，转接时奖愈伤组织切至黄豆大小，再转到光环境下培养，光照强度为1500lx，光照时间为12h/d。
[0025]上述愈伤诱导培养基、增殖培养基，均加入蔗糖30g/L和琼脂7g/L，其ph值为5.5，
其培养环境温度控制为25
±
1℃。
[0026]一、消毒方法对愈伤诱导的影响将剥去外壳的种子于超净工作台中进行表面杀菌处理，在75%酒精和2%NaClO以及0.1%HgCl2处理后均使用无菌水冲洗5~6次。将消毒好的种子放于无菌水中备用，接种时取出种子置于滤纸上吸干水分，然后切除胚芽再纵切去除胚，余下的胚乳接种于WPM+6
‑
BA 1.0mg/L+2，4
‑
D 2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L的培养基中，Ph为5.8，每个处理重复3次，每个重复接种30个外植体，持续观察记录外植体污染与生长状况并拍照，30d后统计愈伤组织诱导率、外植体污染率与死亡率，结果如表1。
[0027]从表1可以看出，使用HgCl2消毒的三个处理愈伤诱导率都很低甚至为0，而死亡率都很高；而用NaClO消毒的三个处理的愈伤诱导率高达67.7%，最低的也为40%，死亡率最高的也仅仅为22.本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种马尾松胚乳二倍体愈伤组织诱导与增殖的方法，其特征在于，包括以下步骤：a）取成熟马尾松种子，剥去种壳后置于4℃冰箱过夜；b）配置愈伤组织诱导培养基，加入培养基成分后溶于1L纯净水中，加热溶解调节ph值之后分装入组培瓶中，于121℃灭菌25min，冷却后取出备用；c）在超净工作台中对去壳后的种子进行消毒灭菌，先使用酒精消毒，消毒后用无菌水冲洗3~5次，再使用NaClO消毒，之后无菌水冲洗3~5次；d）将消毒后的种子用灭菌后的滤纸吸干表面水分，再纵切种胚取出，接种于配置好的愈伤组织诱导培养基中，置于25℃条件下暗培养2个月；e）配置愈伤继代培养基，配置方式与步骤b)相同；f）每隔一个月，将愈伤组织从诱导培养基中转接入继代培养基，转接时将愈伤组织切至黄豆大小，再转到光环境下培养；g）对各次继代的愈伤组织进行染色体倍性鉴定，计算二倍体细胞的比例；h）愈伤细胞染色体倍性稳定后，此时愈伤组织二倍体细胞比例高达86%，对愈伤组织进行增殖培养，将愈伤组织从继代培养基中转接入增殖培养基，转接时将愈伤组织切至黄豆大小。2.如权利要求1所述的一种马尾松胚乳二倍体愈伤组织诱导与增殖的方法，其特征在于：所述步骤b)与e）中，培养基的成分配方为DCR+NAA2mg/L+6

【专利技术属性】
技术研发人员：田雨风，徐刚，丁贵杰，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：