一种快速提取生物核酸的样品处理方法技术

本发明专利技术提供一种快速提取生物核酸的样品处理方法——浓缩酶解法、生物核酸提取方法以及试剂盒。该方法具有下列优点：1、操作简单，细胞酶解更彻底；2、极大缩短提取时间，提高工作效率；3、提高生物核酸的产量；4、室温。室温。室温。

【技术实现步骤摘要】
一种快速提取生物核酸的样品处理方法


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体地涉及一种生物核酸快速提取的样品处理方法、核酸提取方法及提取试剂盒。

技术介绍

[0002]随着基因组测序技术的发展，生物基因组的序列、结构和功能研究飞速发展，而获得高纯度、高含量和高完整度的生物基因组DNA是基因组测序技术得以应用的首要前提。随着生物学的发展，基因的转录产物RNA的研究也越来越受到研究者们的青睐。
[0003]越来越多的DNA、RNA以及两者共提的提取方法被开发出来。具体来说，传统的生物基因组DNA提取方法主要有CTAB和SDS法，常见的生物RNA提取方法主要有Trizol法、硫氰酸胍/酚法、SDS/酚法、盐酸胍法等。
[0004]对于生物样品核酸提取的质和量不仅与提取配方有关还与生物样品的处理方式和/或处理方法有关。于是一些生物样品的处理方法不断的涌现出来，如：机械方法，包括高速组织捣碎机、玻璃匀浆器等；物理方法，包括反复冻融法、冷热变替法、超声波法、加压破碎法等；化学及生物学法，包括有机溶剂提取法，水溶液提取法和酶法等。
[0005]被实验室广泛应用的方式和方法中，主要有机械法、酶法和液氮研磨法。各种方法各有其优缺点。机械法的优点：效率高，有利于自动化；其缺点：成本高。酶法：液氮冷冻干燥研磨法，优点：研磨效果好，可以快速提取生物核酸，缺点：不利于自动化。传统的酶法，优点：有利于自动化，缺点：酶解速度慢。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供克服至少一种上述现有技术缺点的方法和常温快速核酸提取试剂盒。
[0007]如权利要求1所述，一种生物核酸快速提取样品的处理方法，其特征在于包括以下步骤：
[0008]a)处理生物样品，包含但不限于液氮冷冻研磨法、机械研磨法、高速离心法和/或加入防止核酸降解的抑制剂等，以获得小体积的细胞和/或极细小生物组织聚集体；
[0009]b)加入小体积高浓度的蛋白酶，包含但不限于，蛋白酶K、溶菌酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等；
[0010]跟据权利要求1a)所述，其特征在于：对固态生物样品，加入和/或核酸降解抑制剂和/或再加入高浓度的酶，经过包含但不限于液氮冷冻研磨法、机械研磨法等，获得极细小的生物样品组织；对于液体中含有细胞的生物样品，和/或加入防止核酸降解的抑制剂，离心去除上清，获得生物样品细胞。
[0011]为了区别传统的酶解法，本专利所提供的酶解方法特点在于体积小且酶的浓度比较高，所以称该方法为浓缩酶解法。
[0012]更具体来说，对于DNA降解抑制剂包含但不限于，和/或一种或一种以上螯合剂化
合物，优先选自，包含但不限于：N
‑
乙酰
‑
L
‑
半胱氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、乙二胺
‑
N，N
′‑
二琥珀酸(EDDS)、1，2
‑
双(邻氨基苯氧基)乙烷
‑
N，N，N
′
，N
′‑
四乙酸(BAPTA)和膦酸盐螯合剂(例如包括但不限于次氮基三(亚甲基)膦酸(NTMP)、乙二胺四(亚甲基膦酸)(EDTMP)、二亚乙基三胺五(亚甲基)膦酸(DTPMP)、1
‑
羟基亚乙基
‑
1，1
‑
二膦酸(HEDP)等)，优选EDTA。
[0013]更具体来说，对于RNA降解抑制剂包含但不限于美国专利第6825340号说明书或美国专利第677720号说明书中公开的一些还原剂。在一些实施方案中，常用的RNaseA抑制剂为焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液。
[0014]优选实施方式中，高浓度酶与细胞和/或极细小的生物样品组织混匀后，总体积还是非常小的，这样就拉近酶与底物作用距离加快酶解反应，使细胞和/或极细小的生物样品组织被彻底酶解，让生物核酸暴露出来，与核酸提取液充分接触，不仅可以加快核酸提取过程而且还可以增加核酸提取量。
[0015]根据权利要求1b)所述，其特征在于：和/或加入高浓度蛋白酶，具体来说大于0.5mg/ml，优选在2mg/ml～50mg/ml，更有选在5mg/ml～30mg/ml；所用高浓度蛋白酶体积在1ul～100ul，优选在5ul～50ul，更优选在10ul～30ul；把酶和经过步骤a)处理后的生物样品混匀，放置一段时间，优选1分钟～10分钟。更优选1分钟～3分钟。
[0016]为了区别传统的酶解法，本专利所提供的酶解方法特点在于体积小且酶的浓度比较高，所以，把该方法定义为浓缩酶解法。
[0017]出于本专利技术的目的，术语“核酸”表示包含但不限于：天然，优选分离的、线性、支化或环状核酸如RNA，具体是mRNA、siRNA、miRNA、snRNA、tRNA、hnRNA、microRNA或核酶，DNA，质粒DNA，线粒体DNA等。
[0018]出于本专利技术的目的，术语“螯合剂”表示能够螯合金属离子的化合物，如EDTA等。
[0019]优选实施方式中，处理后的生物样品核酸提取方法包括以下步骤：
[0020]A)把酶解后的生物样品与裂解液混匀；
[0021]B)在含有核酸的裂解液和/或溶液和/或支化或非支化链烷醇的存在下，将释放的核酸固定到基于一种基质或一种以上基质混合物上，包含但不限于离心柱、磁球等；
[0022]C)任选地洗涤固定在基质上的核酸；
[0023]D)任选地洗脱结合在基质上的核酸。
[0024]在优选实施方式中，尤其是裂解液还可包含和/或临时加入酶，例如裂解酶、RNase A、DNase I，具体说，例如蛋白酶K，蛋白酶，消解酶，无色肽酶，溶细胞酶，溶葡萄球菌酶，溶菌酶和核酶等。
[0025]在裂解液的存在下，优选支化或非支化链烷醇的存在下，将核酸固定到基质上。因此，优选包含至少一种支链或非支链烷醇的结合试剂。
[0026]优选有用的是具有1～5个碳原子的短链支化或非支化链烷醇。根据本专利技术一优选的实施方式，支化或非支化烷醇是具有1～5个碳原子的醇，优选选自：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、支化或非支化丁醇或戊醇、和/或它们的混合物。
[0027]除非另有说明，定义“支化或非支化链烷醇”，具体是乙醇、丙醇，丁醇和戊醇包括任何可消耗的具体基团的异构体形式。因此，例如，支化或非支化丙醇包括正丙醇和异丙醇，支化或非支化丁醇包括正丁醇、异丁醇、仲丁醇、和叔丁醇，支化或非支化戊醇包括例如
正戊醇和异戊醇。优选使用选自下组的醇：甲醇、乙醇、异丙醇、和/或其混合物，尤其优选使用选自下组的醇：乙醇、异丙醇和/或其混合物。
[0028]根据所述方法一优选的实施方式，所述缓冲化合物选自：三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、N
‑
(三(羟甲基)甲基)甘氨酸(TRICINE)、N，N
‑
双(2
‑
羟乙基)甘氨本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速提取生物核酸的样品处理方法，其特征在于包括以下步骤：a)处理生物样品，包含但不限于液氮冷冻研磨法、机械研磨法、高速离心法和/或加入防止核酸降解的抑制剂等，以获得小体积的细胞和/或极细小生物组织聚集体；b)加入小体积高浓度的蛋白酶，包含但不限于，蛋白酶K，蛋白酶，消解酶，无色肽酶，溶细胞酶，溶葡萄球菌酶，溶菌酶和核酶等。2.根据权利要求1a)所述，其特征在于：对固态生物样品，加入和/或核酸降解抑制剂和/或再加入高浓度的酶，经过包含但不限于液氮冷冻研磨法、机械研磨法等，获得极细小的生物样品组织；对于液体中含有细胞的生物样品，和/或加入防止核酸降解的抑制剂，离心去除上清，获得生物样品细胞。3.根据权利要求1b)所述，其特征在于：和/或加入高浓度蛋白酶，具体来说大于0.2mg/ml，优选在2mg/ml～50mg/ml，更有选在5mg/ml～30mg/ml；所用高浓度蛋白酶体积在1ul～100ul，优选在5ul～50ul，更优选在10ul～30ul；把酶和经过步骤a)处理后的生物样品混匀，放置一段时间，优选1分钟～10分钟。更优选1分钟～3分钟。4.根据权利1实施方式，处理后的生物样品核酸提取方法包含以下步骤：A)把酶解后的生物样品与裂解液混匀；B)在含有核酸的裂解液和/或溶液和/或支化或非支化链烷醇的存在下，将释放的核酸固定到基于一种基质或一种以上基质混合物上，包含但不限于离心柱、磁球等；C)任选地洗涤固定在基质上的核酸；D)任选地洗脱结合在基质上的核酸。5.根据权利要求4B)所述，其特征在于，所述的结合试剂包含但不限于支化或非支化的链烷醇，具体说，具有1～5个碳原子的短链支化或非支化链烷醇。支化或非支化丁醇包括正丁醇、异丁醇、仲丁醇、和叔丁醇；支化或非支化戊醇包括例如正戊醇和异戊醇。优选使用选自下组的醇：甲醇、乙醇、异丙...

【专利技术属性】
技术研发人员：张怀远，丁玮云，李海文，
申请(专利权)人：汉远化生医国际科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：