一种精子染色质免疫共沉淀方法技术

本发明专利技术公开了一种精子染色质免疫共沉淀方法。属靶向核酸纯化及二代测序建库样本预处理领域。包括精子消化：将精子经多聚甲醛固定、清洗、裂解后，采用微球菌核酸酶消化

【技术实现步骤摘要】
一种精子染色质免疫共沉淀方法


[0001]本专利技术涉及靶向核酸纯化及二代测序建库样本预处理
，更具体的说是涉及一种精子染色质免疫共沉淀方法。

技术介绍

[0002]目前，研究蛋白质间的相互作用的方法有多种，常用的有酵母双杂交洗脱、免疫共沉淀、Pull
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down等方法。其中，免疫共沉淀是相对稳定、简便的方法，也是在蛋白质组的科学研究中得到了广泛应用的一种方法。
[0003]免疫共沉淀是以抗体和抗原之间特异性结合为基础的用于研究蛋白质相互作用的技术。主要利用非变性剂裂解完整细胞，维持了细胞内许多蛋白质间的相互作用，便于检测蛋白质之间的相互作用。利用抗蛋白质A的抗体与A形成免疫复合物并沉淀，而细胞内与A稳定结合的蛋白质B同时被沉淀下来。蛋白质B的沉淀是基于与A的物理性相互作用，这种技术被称为免疫共沉淀。该技术利用抗原抗体形成蛋白复合物沉淀，将蛋白质复合物溶解，再将蛋白质B分离出来。免疫共沉淀方法是确定两种蛋白质在细胞生理条件下相互作用的有效方法。
[0004]然而由于精子上含有的组蛋白量很少(大约为6～15％)，因此现有技术中针对精子的组蛋白修饰相关的免疫共沉淀方法效率都比较低。
[0005]综上，如何提供一种效率高的精子染色质免疫共沉淀方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术提供了一种精子染色质免疫共沉淀方法。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]一种精子染色质免疫共沉淀方法，包括如下步骤：
[0009](1)精子消化：将精子经多聚甲醛固定、清洗、裂解后，采用微球菌核酸酶消化
‑
超声相结合的方法对精子进行消化，得消化液；其中，
[0010]超声参数：超声30s(选择超声装置的低功率)、间隔45s，10个循环；
[0011]微球菌核酸酶消化参数：酶加入量为200U/106个精子，酶解温度37℃，酶解时间30min；
[0012](2)染色质分离：将所述消化液经初清后得染色质；
[0013](3)染色质免疫共沉淀：抗体与protein A agarose形成复合物，再与染色质中相应的抗原结合，之后经清洗、洗脱后得免疫共沉淀反应液。
[0014]进一步的，所述步骤(1)的具体操作为：
[0015](11)将精子使用质量浓度为0.5％的多聚甲醛固定；
[0016](12)20～25℃、5,000g，离心10min，弃上清；
[0017](13)加入4℃预冷的PBS进行清洗，之后20～25℃、5,000g，离心10min，弃上清，保
留精子沉淀；
[0018](14)按照500μl/106个精子的量加入裂解液，20～25℃孵育1hr，得混合液A；
[0019]所述裂解液包括如下质量浓度的组分：0.5％的SDS和10mM的DTT；
[0020](15)裂解后加入1M的N
‑
乙基顺丁烯二酰亚胺；
[0021](16)之后采用超声处理，超声30s(选择超声装置的低功率)、间隔45s，10个循环；超声后使用微球菌核酸酶消化，酶加入量为200U/106个精子，酶解温度37℃，酶解时间30min，得消化液。
[0022]取得的有益效果：使染色质充分释放。
[0023]进一步的，所述步骤(2)的具体操作为：
[0024](21)向消化液中加入等比例的稀释缓冲液，所述稀释缓冲液包括如下质量浓度的组分：1％Triton X
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100、2mM EDTA、150mM NaCl、20mM Tris
‑
HCl，pH8.0；
[0025](22)加入protein A agarose在4℃条件下震荡2hr，进行初清；
[0026](23)5,000rpm离心1min，保留上清液即为染色质。
[0027]取得的有益效果：获得足够多的染色质。
[0028]进一步的，步骤(3)中所述抗体为H3K4me2或H3K27me3的抗体。
[0029]进一步的，所述步骤(3)的具体操作为：
[0030](31)向所述染色质中加入抗体，染色质与抗体的体积质量比为8μl:1μg，4℃震荡过夜；
[0031](32)加入染色质体积4/5的protein A agarose，震荡2hr；
[0032](33)5,000rpm离心1min，弃上清；
[0033](34)先后以TSEⅠ，TSEⅡ，缓冲液Ⅲ和TE缓冲液各洗涤两次，每次4℃震荡2min，弃上清，得免疫共沉淀后样品；
[0034]所述TSEⅠ包括如下质量浓度的组分：20mM Tris
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HCl、0.5M EDTA、0.1％SDS、150mM NaCl和1％TritonX
‑
100，pH8.0；
[0035]所述TSEⅡ包括如下质量浓度的组分：20mM Tris
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HCl、0.5M EDTA、0.1％SDS、500mM NaCl和1％TritonX
‑
100，pH8.0；
[0036]所述缓冲液Ⅲ包括如下质量浓度的组分：10mM Tris
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HCl、1mM EDTA、1％NP
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40和1％脱氧胆酸钠，pH8.0；
[0037]所述TE缓冲液包括如下质量浓度的组分：10mM Tris
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HCl和0.5M EDTA，pH8.0；
[0038](35)免疫共沉淀后样品加入染色质5倍体积的洗脱液重悬，65℃水浴5min，继而20～25℃震荡15min；
[0039]所述洗脱液包括如下质量浓度的组分：1％的SDS和0.1M的NaHCO3；
[0040](36)12,000rpm离心2min，取洗脱上清液；
[0041](37)重复35～36，将两次洗脱上清液合并；
[0042](38)向洗脱上清液中加入其0.04倍体积的5M NaCl，0.01倍体积的2mg/ml RNase，65℃水浴4hr；
[0043](39)加入洗脱上清液0.02倍体积的0.5M EDTA，0.04倍体积的1.5M Tris
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HCl，0.01倍体积的蛋白酶K，65℃水浴2hr，得免疫共沉淀反应液。
[0044]取得的有益效果：去除与DNA结合的蛋白，方便后续DNA的纯化和检测。
[0045]经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术取得的有益效果为：把超声与酶消化结合起来，大大提高消化效率，显著增加DNA的回收率，有助于降低后续建库的难度，大大提高了精子免疫共沉淀的效率。
附图说明
[0046]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种精子染色质免疫共沉淀方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)精子消化：将精子经多聚甲醛固定、清洗、裂解后，采用微球菌核酸酶消化
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超声相结合的方法对精子进行消化，得消化液；其中，超声参数：超声30s、间隔45s，10个循环；微球菌核酸酶消化参数：酶加入量为200U/106个精子，酶解温度37℃，酶解时间30min；(2)染色质分离：将所述消化液经初清后得染色质；(3)染色质免疫共沉淀：抗体与protein A agarose形成复合物，再与染色质中相应的抗原结合，之后经清洗、洗脱后得免疫共沉淀反应液。2.如权利要求1所述的一种精子染色质免疫共沉淀方法，其特征在于，所述步骤(1)的具体操作为：(11)将精子使用质量浓度为0.5％的多聚甲醛固定；(12)20～25℃、5,000g，离心10min，弃上清；(13)加入4℃预冷的PBS进行清洗，之后20～25℃、5,000g，离心10min，弃上清，保留精子沉淀；(14)按照500μl/106个精子的量加入裂解液，20～25℃孵育1hr，得混合液A；所述裂解液包括如下质量浓度的组分：0.5％的SDS和10mM的DTT；(15)裂解后加入1MN
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乙基顺丁烯二酰亚胺；(16)之后采用超声处理，超声30s、间隔45s，10个循环；超声后使用微球菌核酸酶消化，酶加入量为200U/106个精子，酶解温度37℃，酶解时间30min，得消化液。3.如权利要求1所述的一种精子染色质免疫共沉淀方法，其特征在于，所述步骤(2)的具体操作为：(21)向消化液中加入等比例的稀释缓冲液，所述稀释缓冲液包括如下质量浓度的组分：1％Triton X
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100、2mM EDTA、150mM NaCl、20mM Tris
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HCl，pH8.0；(22)加入proteinA agarose在4℃条件下震荡2hr，进行初清；(23)5,000rpm离心1min，保留上清液即为染色质，取1/10体积作为input样品，其余样品进行后续操作。4.如权利要求1所述的一种精子染色质免疫共沉淀方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：茹彦飞，施惠娟，华敏敏，张天成，顾一骅，汤佳楠，王雪梅，
申请(专利权)人：上海市生物医药技术研究院，
类型：发明
国别省市：