选择和检测结合肽的方法技术

本发明专利技术提供选择、检测和/或富集与靶标结合的肽的方法。合的肽的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】选择和检测结合肽的方法


[0001]本专利技术属于mRNA展示
更具体地，本专利技术涉及针对细胞表达的或可溶性的肽来选择、检测和/或富集肽的方法、以及具有期望功能特性的肽。

技术介绍

[0002]信使RNA(mRNA)展示是一种针对可溶性肽和可溶性蛋白质的选择技术。(Szostak R.et al.,RNA
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peptide fusions for the in vitro selection of peptides and proteins.Proc.Natl.Acad.Sci.94,12297
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12302(1997))。采用信使RNA展示能够构建高度多样化的肽库，其中可以包括天然氨基酸和非天然氨基酸。可以通过不同的方法并入非天然氨基酸，包括抑制琥珀密码子和利用修饰的tRNA(非天然氨基酸与tRNA的化学缀合物)或使用由人工核酶制成的高度灵活的tRNA氨酰化酶(称为flexizymes)(Niwa N.et al.,A flexizyme that selectively charges amino acids activated by a water
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friendly leaving group.Bioorganic&Med.Chem.Letters 19(14),3892
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3894(2009))。
[0003]应用mRNA 展示来选择肽的方法传统上包括从DNA 变体库转录mRNA并将这些mRNA变体退火到短DNA接头上，该接头在其3'末端与嘌呤霉素缀合(Ishizawa T.et al.,TRAP Display:A High
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Speed Selection Method for the Generation of Functional Polypeptides.J.Am.Chem.Soc.135(14),5433
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5440(2013))。这将产生一个mRNA:DNA接头
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嘌呤霉素文库。通过添加细菌或兔网织红细胞裂解物或Pure启动翻译。
[0004]在翻译过程中，核糖体沿着单个mRNA移动，并将存储在mRNA中的遗传信息翻译成肽序列。当核糖体遇到设计在肽序列末端的TAG终止密码子时，它们会在没有释放因子1的情况下停滞，从而允许嘌呤霉素进入核糖体位点A。结果，嘌呤霉素在多肽生长链和mRNA之间形成共价键。翻译停止，与融合嘌呤霉素的DNA接头杂交的mRNA现在与肽相连。然后将mRNA逆转录为cDNA以允许进行PCR扩增和生成在选择过程中具有减少的非特异性结合的稳定DNA:RNA双链体。针对感兴趣的靶标，选择文库，洗去非特异性肽，并洗脱结合物(binder)。通过定量PCR(qPCR)监测选择效率。下一代测序用于确定多轮序列后富集的肽序列。
[0005]虽然通过mRNA文库选择已经产生了针对可溶性肽的特异性强结合物，但mRNA展示并不适用于针对细胞表达的靶标的选择。因此，仍然需要针对细胞表达的靶标例如蛋白质或蛋白质类似物进行选择的方法。此外，大多数先前的方法使用qPCR来确定输出与输入分子的比率(百分比回收率)以确定效率。然而，选择的肽既包括特异性结合物也包括非特异性结合物。因此，需要仅选择特异性结合物的方法。
[0006]专利技术概述
[0007]因此，本专利技术提供了针对细胞表达的和可溶性的肽或肽类似物来选择mRNA展示文库的方法。本专利技术还提供了一种以定量方式监测每一轮选择中靶特异性肽的富集的手段，这将是更为准确的用于确定效率的度量方式。此外，可以基于实时获得的数据修改本专利技术的选择条件，以针对可溶性和细胞表达的靶标进行选择。此外，本专利技术允许并入FACS以针对
细胞表达的和重组的蛋白选择靶特异性的肽，允许进行功能选择(选择在基于细胞的测定中具有期望功能的肽)，并能够鉴定在细胞中内化的肽。
[0008]嘌呤霉素连接到短DNA接头上以获得嘌呤霉素
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DNA 接头。然后将荧光团与嘌呤霉素
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DNA接头的5'末端融合，从而使所得DNA接头在其3'末端与嘌呤霉素融合，并在其5'末端与荧光团融合。因此，当与DNA接头退火时，文库中的每个mRNA
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DNA
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肽分子都会自动带上荧光团标记，从而实现FACS和流式细胞术与mRNA展示平台的集成。在类似的方法中，可以将标签(例如FLAG
TM
标签)并入mRNA
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DNA
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肽复合物中，以便对该标签具有特异性的荧光肽、抗体或其他荧光分子与mRNA
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DNA
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肽分子结合，从而实现FACS和流式细胞术的整合。
[0009]FACS和流式细胞术的这种整合提供了一种在每轮选择中以定量方式监测靶特异性肽富集的手段，而先前的方法使用qPCR来确定输出与输入分子的比率(百分比回收率)。本专利技术的方法提供了优于qPCR百分比回收率测定的优势，对于后者，在每一轮选择期间，特异性和非特异性结合物均被选择。因此，使用qPCR百分比回收率测定导致的是，在每轮选择中对特异性和非特异性结合物两者的量度。而通过流式细胞术和FACS的富集和选择允许选择大部分特异性的结合物。
[0010]本专利技术的方法也是有利的，因为可以基于实时获得的数据修改选择条件。此外，这种方法允许结合FACS以针对细胞表达的和重组的蛋白来选择靶特异性肽，允许进行功能选择，并能够鉴定可以细胞内化的肽。
[0011]因此，本专利技术提供检测或选择靶标的结合肽的方法，其中该方法包括检测或选择与至少一种可检测物质连接的mRNA
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DNA
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肽复合物。在一个实施方案中，可检测物质是荧光团。在一个特定实施方案中，荧光团是有机染料、生物荧光团或量子点。在一个特定实施方案中，可检测物质是Alexa Fluor。在一些实施方案中，可检测物质与嘌呤霉素接头缀合。
[0012]本专利技术还提供了检测或选择靶标的结合肽的方法，其中该方法包括检测或选择与至少一种可检测物质连接的mRNA
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DNA
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肽复合物，并且其中可检测物质是标签。在一个实施方案中，标签包含天然或非天然氨基酸。在一个实施方案中，标签是肽标签。在一个特定的实施方案中，肽标签是FLAG
TM
标签。在一个实施方案中，标签通过荧光分子检测。在一个特定的实施方案中，通过荧光肽检测标签。在另一个特定的实施方案中，标签通过荧光抗体检测。
[0013]在一个实施方案中，本专利技术的方法包括固定在能够进行分选的材料上的靶标。在一个特定实施方案中，能够进行分选的材料是珠子。在一个实施方案中，靶标是肽、蛋白质、核酸、糖、脂质、哺乳动物细胞或哺乳动物细胞提取物。在一个特定的实施方案中，靶标是肽或蛋白质。
[0014]在一个实施方案中，本专利技术的方法包括包含至少一个非天然氨基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.检测或选择靶标的结合肽的方法，其中所述方法包括检测或选择与至少一种可检测物质连接的mRNA
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DNA
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肽复合物。2.权利要求1的方法，其中可检测物质是荧光团。3.权利要求2的方法，其中荧光团是有机染料、生物荧光团、或量子点。4.权利要求1
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3任一项的方法，其中可检测物质是Alexa Fluor。5.权利要求1
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4任一项的方法，其中可检测物质与嘌呤霉素接头缀合。6.权利要求1的方法，其中可检测物质是标签(tag)。7.权利要求6的方法，其中标签是肽标签。8.权利要求6或权利要求7的方法，其中标签是FLAG
TM
标签。9.权利要求6
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8任一项的方法，其中标签通过荧光分子检测。10.权利要求9的方法，其中荧光分子是荧光肽。11.权利要求9或权利要求10的方法，其中荧光分子是荧光抗体。12.权利要求1
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11任一项的方法，其中靶标固定在允许进行分选的材料上。13.权利要求12的方法，其中允许进行分选的材料是珠子。14.权利要求1
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13任一项的方法，其中靶标是肽、蛋白、核酸、糖、脂质、哺乳动物细胞、或哺乳动物细胞提取物。15.权利要求14的方法，其中靶标是肽或蛋白。16.权利要求1
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15任一项的方法，其中结合肽包含至少一个非天然氨基酸。17.权利要求1
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16任一项的方法，其中结合肽通过可检测物质检测或分选。18.权利要求1
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17任一项的方法，其中结合肽通过FACS、流式细胞术、ELISA、分光光度法、荧光光谱法或显微术检测或选择。19.权利要求1
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18任一项的方法，其中结合肽通过流式细胞术检测。20.权利要求1
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18任一项的方法，其中结合肽通过FACS选择。21.权利要求1
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18任一项的方法，其中检测并选择结合肽。22.权利要求21的方法，其中通过流式细胞术检测结合肽。23.权利要求21或权利要求22的方法，其中结合肽通过FACS选择。24.权利要求1的方法，其中所述方法包括：a)将至少一种可检测物质掺入mRNA文库以产生mRNA
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可检测物质复合物；b)翻译所述mRNA
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可检测物质复合物以产生mRNA
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肽
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可检测物质复合物；和c)逆转录所述mRNA
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肽
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可检测物质复合物以获得mRNA
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DNA
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肽
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可检测物质复合物。25.权利要求24的方法，其中所述mRNA
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DNA
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肽
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可检测物质复合物通过流式细胞术检测。26.权利要求24或权利要求25的方法，其中所述mRNA
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DNA
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肽
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【专利技术属性】
技术研发人员：S，
申请(专利权)人：伊莱利利公司，
类型：发明
国别省市：