能有效编辑猪PCBP1基因的sgRNA及其应用制造技术

本发明专利技术提供一条能有效敲除猪PCBP1基因的sgRNA，其特征在于：所述sgRNA特异性靶向猪PCBP1基因的第485位到504位的序列，其编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。本发明专利技术利用CRISPR/Cas9技术，成功地在PK15细胞系中敲除了PCBP1基因，结果显示该敲除细胞系能够在一定程度上抑制CSFV在细胞中的增殖，为制备PCBP1敲除的具有先天的抗CSFV能力的基因编辑猪提供了可能，对于抗猪瘟病毒药物靶点筛选研究及抗病毒猪的遗传育种具有重要意义。究及抗病毒猪的遗传育种具有重要意义。究及抗病毒猪的遗传育种具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
能有效编辑猪PCBP1基因的sgRNA及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一条能有效编辑猪PCBP1基因的sgRNA及应用该sgRNA获得的PCBP1敲除的细胞系。

技术介绍

[0002]聚(rC)结合蛋白1是属于PCBPs家族的相对分子量大小为38kDa的RNA或者DNA结合蛋白。PCBPs家族的成员包括PCBP1
‑
4,hnRNP K五个成员，PCBP1是无内含子基因，有报道称，PCBP1蛋白能够通过降解衔接蛋白MAVS来抑制RLR介导的信号通路。同时该蛋白还会以病毒感染依赖的方式促进cGAS结合胞质中的DNA，最近文献表明，PCBP1蛋白能够通过与经典猪瘟病毒(CSFV)的N
pro
互作，促进CSFV的复制。因此该基因位点可以作为抗CSFV的潜在药物靶点以及对于抗CSFV转基因猪的制备有着重要意义。
[0003]CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相应的CRISPR RNAs(crRNAs)来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。后来，研究人员发现，它更是一种精确且万能基因编辑工具，可以用来删除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因，包括人、老鼠、猪、牛、羊、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物等的基因。利用这种机制可以实现基因组的精确编辑，如条件性基因敲除、基因敲进、基因替换、点突变等等。CRISPR/Cas9技术以自己操作的便捷性，高效的基因编辑能力获得青睐，该技术面世以后，弥补了传统基因编辑技术的诸多不足，在基因编辑领域有着广阔的应用前景。本专利技术基于前期建立的CRISPR/Cas9定点编辑平台，以猪胎儿成纤维细胞和PK
‑
15细胞为研究对象，探究猪PCBP1基因对猪瘟病毒感染的影响。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一条能有效敲除猪PCBP1基因的sgRNA序列，基于该sgRNA，采用CRISPR/Cas9系统可制备猪PCBP1基因敲除细胞和猪模型。
[0005]为实现上述目的，本专利技术首先提供了特异性靶向猪PCBP1基因的sgRNA，其靶向猪PCBP1基因的第485位到504位的序列。
[0006]本专利技术通过大量筛选发现采用上述序列作为靶标序列，具有较高的打靶效率和敲除效率。
[0007]针对上述猪PCBP1基因上的靶标序列，本专利技术设计了特异性的sgRNA，并进一步发现了采用SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列对应的sgRNA能够实现较高的打靶效率和PCBP1基因敲除效率。
[0008]作为本专利技术更优的技术方案，所述特异性靶向猪PCBP1基因的sgRNA的编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
[0009]本专利技术还提供一种含有所述特异性靶向猪PCBP1基因的sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体。
[0010]作为本专利技术更优的技术方案，所述CRISPR/Cas9基因敲除载体为连接有所述特异性靶向猪PCBP1基因的sgRNA的载体。
[0011]本专利技术还提供所述CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建方法，其为：将所述特异性靶向猪PCBP1基因的sgRNA与载体连接，得到所述CRISPR/Cas9基因敲除载体。
[0012]作为本专利技术更优的技术方案，所述构建方法包括以下步骤：合成所述sgRNA的编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，其互补链如SEQID NO.2所示，再将单链的sgRNA的DNA序列分别经过退火后形成1条靶向猪PCBP1唯一内含子不同位点的sgRNA的寡核苷酸链；然后将该寡聚核苷酸连入PX330质粒载体中。
[0013]本专利技术还提供所述特异性靶向猪PCBP1基因的sgRNA或包含所述sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体在猪PCBP1基因敲除中的应用。
[0014]本专利技术还提供一种制备PCBP1基因敲除细胞系的方法，其包括：将含有所述特异性靶向猪PCBP1基因的sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体导入细胞，敲除PCBP1基因。将所述CRISPR/Cas9基因敲除载体导入细胞可通过转染等常规生物学方法实现。制备PCBP1基因敲除细胞的方法，将含有所述特异性靶向猪PCBP1基因的sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体导入细胞后，可采用PCR等常规方法筛选阳性细胞。
[0015]本专利技术还提供一种制备PCBP1基因敲除猪模型的方法，其为利用所述CRISPR/Cas9基因敲除载体实现猪PCBP1基因的敲除。
[0016]本专利技术还提供一种试剂盒，所述试剂盒包含所述sgRNA，所述试剂盒的功能为以下一至五中的至少一种：一、特异性识别猪PCBP1基因；二、敲除猪PCBP1基因；三、对猪PCBP1基因进行基因编辑；四、避免猪感染病毒；五、培育或制备基因编辑猪。
[0017]本专利技术的有益效果至少包括：
[0018]本专利技术以猪基因组中的一个能特异识别猪PCBP1基因的sgRNA为前提，利用CRISPR/Cas9技术，成功地在PK15细胞系中敲除了PCBP1基因，结果显示该敲除细胞系能够在一定程度上抑制CSFV在细胞中的增殖，这为制备PCBP1敲除的具有先天的抗CSFV能力的基因编辑猪提供了可能，对于抗猪瘟病毒药物靶点筛选研究及抗病毒猪的遗传育种具有重要意义。
[0019]本专利技术提供的猪PCBP1基因的敲除方法具有很强的实用性，为猪PCBP1基因的功能研究及其应用提供了有效方法和基础。
附图说明
[0020]图1为靶向猪PCBP1基因sgRNA的设计模式图；
[0021]图2为靶向猪PCPB1基因3条sgRNA切割效率的测序峰图；
[0022]图3为PCBP1敲除阳性克隆免疫印迹的检测结果；
[0023]图4为CSFV在野生型PK
‑
15细胞及PCBP1敲除PK
‑
15细胞克隆中的增值曲线。
具体实施方式
[0024]下面将结合实施例对本专利技术的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本专利技术的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本专利技术的宗旨和精神的情况下，可以对本专利技术进行各种修改和替换。
[0025]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0026]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0027]本专利技术通过从数据库中下载猪PCBP1基因的核苷酸序列，基于对猪PCBP1基因序列的分析，根据CRISPR/Cas9识别靶位点的设计原理，进行猪PCBP1基因的靶位点的筛选和针对该靶位点的sgRNA的设计和筛选，最终筛选获得了敲除效率最高的sgRNA
‑
95，如SEQ IDNO.1所示本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一条能有效敲除猪PCBP1基因的sgRNA，其特征在于：所述sgRNA特异性靶向猪PCBP1基因的第485位到504位的序列。2.如权利要求1所述能有效敲除猪PCBP1基因的sgRNA，其特征在于：其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.一种CRISPR/Cas9基因敲除载体，其特征在于：所述CRISPR/Cas9基因敲除载体为连接有所述特异性靶向猪PCBP1基因的sgRNA的载体。4.如权利要求3所述敲除载体构建方法，其特征在于：合成所述sgRNA的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其互补链如SEQ ID NO.2所示，再将单链的sgRNA的DNA序列分别经过退火后形成1条靶向猪PCBP1唯一内含子不同位点的sgRNA的寡核苷酸链；然后将该寡聚核苷酸连入PX...

【专利技术属性】
技术研发人员：欧阳红生，逄大欣，谢子聪，齐春云，唐小春，
申请(专利权)人：吉林大学重庆研究院，
类型：发明
国别省市：