一种基于金簇-二氧化锰纳米片的农药荧光免疫分析法制造技术

本发明专利技术公开了一种基于金簇

【技术实现步骤摘要】
一种基于金簇
‑
二氧化锰纳米片的农药荧光免疫分析法


[0001]本专利技术属于生物传感器技术和食品及环境样品质量安全监测领域，具体涉及一种荧光免疫分析体系的建立，该技术结合了酶标纳米抗体的高度特异性和金纳米簇
‑
二氧化锰纳米片复合材料的良好荧光性能，为现场高灵敏检测农药以及监测农药在植物组织中的残留和降解动态提供一种新方法。

技术介绍

[0002]农药是一种化学物质，常用于保护农产品免受部分杂草、害虫与疾病的侵害，有机磷农药就属于其中一种有效杀虫剂。杀螟硫磷(fenitrothion,FNT)是一种比较常用的有机磷农药，因其成本低廉、获取容易及高效等优点，被广泛用于蔬菜、水果等作物的多种害虫防治。这种广泛的使用使其经常在水环境、陆生环境以及农产品中被检测到。杀螟硫磷不仅对植物有一定的毒性，流行病学研究也表明，长期暴露于FNT环境下可能导致DNA损伤、延迟肌肉无力和降低人类精子中的浓度，甚至对下一代有影响。除此之外，杀螟硫磷在环境中积累的同时又能进入食物链，从而对生态系统构成一定威胁。因此，监测FNT在作物中的降解和残留水平是十分必要的。同时，由于食物基质中存在大量干扰物质，使得FNT的检测非常复杂。传统的酶联免疫吸附法(Enzyme
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linked immunosorbent assay,ELISA)是一种较为简单、有选择性的农药检测方法，然而其灵敏度相对较低，无法满足越来越高的精密度分析要求。基于上述情况，迫切需要开发一种灵敏度高、抗干扰能力强的检测方法。/>[0003]在免疫分析中，分析性能主要受到两部分的影响：具有亲和力的抗体(识别单元)和显色底物体系(信号单元)。纳米抗体与传统的单克隆和多克隆抗体相比，其溶解性与热稳定性更好、结合特异性和亲和力也更高，可以直接与酶基因片段融合形成免疫试剂，这大幅缩短了检测时间。传统的显色体系虽然易于观察、使用方便，然而其应用于检测复杂食品基质中的目标物时灵敏度较低而且受有毒显色底物的限制，如邻苯二胺(o
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Phenylenediamine,OPD)。因此，基于荧光的免疫分析方法(fluorescence immunoassay,FIA)因其优异的检测灵敏度和信号稳定性而逐渐成为传统比色免疫传感的优良替代方案。利用荧光物质取代传统比色底物，可以利用荧光物质的良好荧光特性提高检测灵敏度。金纳米团簇(Gold nanoclusters,AuNCs)因其良好的生物相容性、光稳定性及其特殊的光学和电学特性而受到广泛关注。除上述优势外，AuNCs在蛋白质稳定的条件下容易合成，适合用于生物检测。目前，荧光探针和有猝灭能力的纳米材料的搭配组合已被广泛用于设计生物传感器。二氧化锰纳米片(Manganese dioxide nanoflakes,MnO
2 NFs))具有优异的光吸收能力、较大的表面积，并可被抗氧化剂分解，是开发传感平台的一种优秀的荧光猝灭剂。因此，我们相信在荧光免疫体系中，AuNCs(荧光团)和MnO2 NFs(猝灭剂)的组合将具有很好的传感性能。
[0004]基于上述研究背景，我们提出了将荧光传感平台与免疫体系结合，利用碱性磷酸酶融合杀螟硫磷纳米抗体(The nanobody against FNT linked
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alkaline phosphatase，Nb
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FNT
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ALP)提高免疫体系的识别单元亲和力从而提高抗体的选择性、检测灵敏度与抗干
扰能力，结合荧光物质的优异荧光传感特性，从而提高荧光免疫传感方法在复杂食品基质中检测痕量农药的能力。

技术实现思路

[0005]本专利技术基于Nb
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FNT
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ALP(酶标纳米抗体)和AuNCs
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MnO2NFs(荧光底物)，开发了一种高灵敏的竞争型荧光免疫传感器。固定在96孔板上的包被抗原与FNT竞争捕获Nb
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FNT
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ALP，形成包被抗原
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抗体复合物。AuNCs
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MnO2复合材料用于识别ALP活性，进而评价FNT残留水平，进一步提高了检测性能。除此之外，该方法成功地用于实际样品(自来水、松花江水、苹果、白菜、生菜、大米和西红柿)中FNT的残留测定。同时，成功地利用该方法对小白菜中FNT的降解动态进行了监测。本专利技术通过整合Nb
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FNT
‑
ALP的高选择性和荧光基质AuNCs
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MnO2复合材料的良好光学特性，构建了可用于广泛目标分析的通用免疫传感器。除可以大幅度提升灵敏度外，该专利技术检测步骤由“两步法”(抗原
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一抗
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二抗)变为“一步法”(抗原
‑
酶标纳米抗体)，缩短检测时间，并且有效提升了抗干扰能力，为监测农业和环境样品中的有害物质提供了一个强有力的工具。
[0006]本专利技术的目的可通过如下技术方案实现：
[0007]一种基于金簇
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二氧化锰纳米片的农药荧光免疫分析法的开发，其步骤如下：
[0008]A.AuNCs
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MnO2复合材料的制备：
[0009]取四氯金酸(HAuCl4·
4H2O,10mmol L
‑1)和牛血清白蛋白(BSA,50mg mL
‑1)在37℃静置温育10min，随后将二者按体积比1:1混合。剧烈搅拌5min后，将NaOH(1mol L
‑1)相比于上述混合溶液体积比1:20加入上述溶液中，在37℃下持续剧烈搅拌12h。将得到的黄色AuNCs溶液放入透析袋(1kDa)中提纯。将提纯的AuNCs溶液与超纯水按照体积比1:3.9混合，在室温下温和搅拌5min。随后，将氯化锰(MnCl2·
4H2O,50mmol L
‑1)相比于上述混合溶液1:98加入到上述溶液中，温和搅拌1h。之后，将NaOH(1mol L
‑1)相比于上述混合溶液体积比1:99加入上述溶液中，温和搅拌4h，得到棕色AuNCs
‑
MnO2溶液。最后，用透析袋(1kDa)纯化AuNCs
‑
MnO2溶液。纯化后的AuNCs溶液与棕色AuNCs
‑
MnO2复合溶液需要在4℃下保存。
[0010]B.碱性磷酸酶催化活性的研究：
[0011]通过碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)与L
‑
抗坏血酸
‑2‑
磷酸三钠盐(L
‑
ascorbic acid
‑2‑
phosphate,AAP)的催化反应生成抗坏血酸(Ascorbic acid,AA)，AA可以还原MnO2NFs变为Mn
2+
，恢复AuNCs被猝灭的荧光，产生荧光信号变化，对酶催化活性进行研究。将AAP(100μmol 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于金簇
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二氧化锰纳米片的农药荧光免疫分析法，其特征在于，其步骤如下：A.AuNCs
‑
MnO2复合材料的制备：取HAuCl4·
4H2O和BSA在37℃静置温育10min，随后将二者按体积比1:1混合，剧烈搅拌5min后，将NaOH相比于上述混合溶液体积比1:20加入上述溶液中，在37℃下持续剧烈搅拌12h，将得到的黄色AuNCs溶液放入1kDa透析袋中提纯，将提纯的AuNCs溶液与超纯水按照体积比1:3.9混合，在室温下温和搅拌5min，随后，将MnCl2·
4H2O相比于上述混合溶液1:98加入到上述溶液中，温和搅拌1h，之后，将NaOH相比于上述混合溶液体积比1:99加入上述溶液中，温和搅拌4h，得到棕色AuNCs
‑
MnO2溶液，最后，用1kDa透析袋纯化AuNCs
‑
MnO2溶液，纯化后的AuNCs溶液与棕色AuNCs
‑
MnO2复合溶液需要在4℃下保存，B.碱性磷酸酶催化活性的研究：通过碱性磷酸酶与L
‑
抗坏血酸
‑2‑
磷酸三钠盐的催化反应生成抗坏血酸，抗坏血酸可以还原MnO2纳米片变为Mn
2+
，恢复AuNCs荧光，产生荧光信号变化，对酶催化活性进行研究，将L
‑
抗坏血酸
‑2‑
磷酸三钠盐与不同浓度的ALP按体积比2:1混合，并在37℃孵育30min，然后将上述溶液、Tris
‑
HCl缓冲液和AuNCs
‑
MnO2溶液以3:1:2的比例混合，在37℃孵育10min后，将上述混合物与超纯水按照3:7比例混合，混合后，利用荧光分光光度计进行荧光测量，C.检测杀螟硫磷的荧光免疫分析法：用碳酸盐缓冲液将包被抗原稀释至1μgmL
‑1，于96孔板上包被抗原100μL/孔，4℃孵育过夜，用PBST洗涤3次后，每孔加入300μL牛血清白蛋白，37℃封闭96孔板60min，用PBST洗涤3次后，将Nb
‑
FNT
‑
ALP和不同浓度的FNT按照1:1的比例加入到存在包被抗原的96孔板中，37℃孵育90min后，继续用PBST冲洗3次，然后，在37℃下将超纯水和L
‑
抗坏血酸
‑2‑
磷酸三钠盐按照1:2的比例加入96孔板中，并反应30min，随后，将上述溶液、Tris
‑
HCl缓冲液和AuNCs
‑
MnO2溶液以3:1:2的比例混合，在37℃静置10min，然后，将得到的溶液移到1.5mL离心管中，并与超纯水按照3:7的比例混合，测量荧光值，D.食品实际样品中农药水平监测分析：准备了7种样品：自来水、松花江水、苹果、大白菜、生菜、大米和番茄，来评估本发明在实际食品样品中检测农药的能力，除水样外，均质样品加入FNT标准溶液，上述样品加入乙腈和水5:1混合的提取缓冲液，振摇60min后，向离心管中加入NaCl，涡旋混合上述物质5min，让其沉淀分离，静置30min后，从样品中提取上清液，并采用建立的荧光免疫分析方法进行检测，这之后，种植...

【专利技术属性】
技术研发人员：李红霞，吕婷，王博旭，苏长顺，胡亚楠，王荷蕊，孙春燕，
申请(专利权)人：吉林大学重庆研究院，
类型：发明
国别省市：