一种检测混合体系内目标分子浓度的方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种定量检测目标分子X浓度的方法，其包括：向包括有所述目标分子X的反应系统中添加报告分子A并持续至少第一给定时间，其中所述报告分子A与目标分子X之间有特异结合活性；向所述反应系统中添加竞争分子B，所述竞争分子B与所述报告分子A之间具有特异结合活性而与所述目标分子X不具有任何结合活性，当不存在目标分子X时，所述竞争分子B与所述报告分子A结合时发出给定强度的荧光强度L0；将体系混匀并等待至少第二给定时间后检测所述系统的荧光强度L；在理想浓度范围内，目标分子X的浓度可以与L0‑

【技术实现步骤摘要】
一种检测混合体系内目标分子浓度的方法及试剂盒
[0001]此案是申请日为2020年12月10日、申请号为202011434928.2、专利技术名称为“一种检测混合体系内目标分子浓度的方法及试剂盒”的专利技术专利申请的分案申请。


[0002]本专利技术涉及化学分析
，具体涉及一种检测混合体系内目标分子浓度的方法及试剂盒。

技术介绍

[0003]物质浓度的检测在化工，生物医药，医学等领域应用广泛。20世纪90年代新兴并发展的有关核酸适配体的研究更加促使了这一领域的发展。核酸适配体是一小段经体外筛选得到的寡核苷酸序列或者短的多肽，能与相应的配体进行高亲和力和强特异性的结合，它的出现为化学生物学界和生物医学界提供了一种新的高效快速识别的研究平台，并在许多方面展示了良好的应用前景。
[0004]传统的用核酸适配体对目标分子浓度的检测方法大多需要牵涉到G4联体显色，荧光能量共振转移，复杂的引物探针设计以及较为繁琐的实验过程。这就导致各个检测方法无法在时间，成本，特异性，灵敏度，简单性上达到很好的统一。
[0005]Cas12a蛋白与crRNA复合物可以对某一特定序列的DNA单链进行识别并结合，之后展现出惊人的反式切割活性(trans
‑
cleavage)。因此Cas12a结合体系中的单链DNA荧光报告分子被用于对DNA检测的研究中。近期，张立新和谭高翼团队开发了“猫鼻子”方法，利用小分子别构蛋白在特定小分子存在时释放出DNA的特点，结合Cas12a进行目标分子的检测。但是该方法只能对拥有对应别构蛋白的小分子进行检测，局限性很大。

技术实现思路

[0006]因此，本申请开发了一种针对目标分子的结合适配体和CRISPR技术的检测方法，其命名为Molecularradar(random Molecular aptamer
‑
dependent CRISPR
‑
assistreporter)。该方法可在0.5h之内对任意小分子进行定量检测。
[0007]本申请的技术方案提供了：
[0008]1.一种定量检测目标分子X浓度的方法，其包括：
[0009]向包括有所述目标分子X的反应系统中添加报告分子A并等待至少第一给定时间，其中所述报告分子A与目标分子X之间有特异结合活性；
[0010]向所述反应系统中添加竞争分子B，所述竞争分子B与所述报告分子A之间具有特异结合活性而与所述目标分子X不具有任何结合活性，当不存在目标分子X时，所述竞争分子B与所述报告分子A结合时发出给定强度的荧光强度L0；
[0011]将体系混匀并等待至少第二给定时间后检测所述系统的荧光强度L；
[0012]在理想浓度范围内，目标分子X的浓度可以与L0‑
L值建立线性关系；
[0013]以上述建立的线性关系作为标准曲线，可以由实际测得的荧光强度变化值L0‑
L推
算出目标分子X的浓度。
[0014]2.根据项1所述的方法，其中，所述目标分子X是任意的适合筛选核酸适配体的分子。
[0015]3.根据项2所述的方法，其中，所述报告分子A是ssDNA，所述报告分子ssDNA包括至少两部分：能够与所述目标分子X特异性结合的核酸适配体ssDNA，以及携带荧光基团和淬灭基团以及固定序列的荧光
‑
淬灭探针ssDNA。
[0016]4.根据项3所述的方法，其中，所述竞争分子B是Cas12a/crRNA复合物，其中所述crRNA能够特异性结合报告分子A中的核酸适配体ssDNA。
[0017]5.根据项4所述的方法，其中，所述目标分子是ATP，所述核酸适配体ssDNA的序列是SEQ ID NO.1，所述crRNA的序列是SEQ ID NO.2；
[0018]SEQ ID NO.1(5
’‑3’
):
[0019]ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT
[0020]SEQ ID NO.2(5
’‑3’
):
[0021]UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUCCUCCGCAAUACUCCCCCA。
[0022]6.根据项4所述的方法，其中，所述Cas12a/crRNA复合物与所述核酸适配体ssDNA在使用时的比例为3：1至1.05:1。
[0023]7.根据项4所述的方法，其中，所述荧光
‑
淬灭探针ssDNA的浓度相对于核酸适配体ssDNA或Cas12a/crRNA复合物的浓度来说是过量的。
[0024]8.根据项1所述的方法，其中，为进行所述荧光强度测定使用荧光分析仪。
[0025]9.根据项4所述的方法，其中，所述理想浓度范围为25μM到0.5mM。
[0026]10.根据项4所述的方法，其中所述第一给定时间为15分钟。
[0027]11.根据项4所述的方法，其中所述第二给定时间为10分钟。
[0028]12.一种用于测定目标分子X的浓度的试剂盒，其至少包括报告分子A和竞争分子B，其中所述报告分子A能够与所述目标分子X特异性结合，而所述竞争分子B能够与所述报告分子A特异性结合并且不与所述目标分子X发生任何方式的结合；当不存在所述目标分子X时，所述竞争分子B与所述报告分子A结合时发出给定强度的荧光强度L0。
[0029]13.根据项12所述的试剂盒，其中，所述目标分子X是任意的适合筛选核酸适配体的分子。
[0030]14.根据项13所述的试剂盒，其中，所述报告分子A是ssDNA，所述报告分子ssDNA包括至少两部分：能够与所述目标分子X特异性结合的核酸适配体ssDNA，以及携带荧光基团和淬灭基团以及固定序列的荧光
‑
淬灭探针ssDNA。
[0031]15.根据项14所述的试剂盒，其中，所述竞争分子B是Crispr
‑
Cas12a/crRNA复合物，其中所述crRNA能够特异性结合报告分子A中的核酸适配体ssDNA。16.根据项15所述的试剂盒，其中，所述目标分子是ATP，所述核酸适配体ssDNA的序列是SEQ ID NO.1，所述crRNA的序列是SEQ IDNO.2。
[0032]17.根据项15所述的试剂盒，其中，所述Cas12a/crRNA复合物与所述核酸适配体ssDNA在使用时的比例为3：1至1.05:1。
[0033]18.根据项15所述的试剂盒，其中，所述荧光
‑
淬灭探针ssDNA在使用时的浓度相对于核酸适配体ssDNA或Cas12a/crRNA复合物的浓度来说是过量的。
[0034]本申请的技术方案取得的有益技术效果：
[0035]本申请的技术方案相较于其他检测技术的优点在于，有潜力针对各种类型的分子筛选出合适的核酸适配体从而建立检测方法来替代传统方法，同时操作简单、耗时极短(可以在10
‑
30min内获得结果)且本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种定量检测目标分子X浓度的方法，其包括：向包括有所述目标分子X的反应系统中添加报告分子A并等待第一给定时间，其中所述报告分子A与目标分子X之间存在特异结合活性；向所述反应系统中添加竞争分子B，所述竞争分子B与所述报告分子A之间存在特异结合活性而与所述目标分子X之间不存在结合活性，当不存在目标分子X时，所述竞争分子B与所述报告分子A结合时发出给定强度的荧光强度，即L0；将添加竞争分子B后的反应体系混匀并等待第二给定时间后检测所述反应系统的荧光强度L；在给定的浓度范围内，目标分子X的浓度可以与L0‑
L值建立线性关系；以上述建立的线性关系作为标准曲线，可以由实际测得的荧光强度变化值L0‑
L推算出目标分子X的浓度。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述目标分子X是能够筛选出核酸适配体的分子。3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述报告分子A是ssDNA(单链DNA，single strand DNA)，所述报告分子ssDNA包括至少两部分：能够与所述目标分子X特异性结合的核酸适配体ssDNA，以及携带荧光基团和淬灭基团以及固定序列的荧光
‑
淬灭探针ssDNA。4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述竞争分子B是Cas12a/crRNA复合物，其中所述crRNA能够特异性结合报告分子A中的核酸适配体ssDNA。5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述目标分子是ATP，所述核酸适配体ssDNA的序列是SEQ ID NO.1，所述crRNA的序列是SEQ ID NO.2；SEQ ID NO.1(5
’‑3’
):ACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGTSEQ ID NO.2(5
’‑3’
):UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUCCUCCGCAAUACUCCCCCA。6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述Cas12a/crRNA复合物与所述核酸适配体ssDNA在使用时的比例为3:1至1.05:1。7.根据权利要求4所述的方法，其中，所述荧光...

【专利技术属性】
技术研发人员：张翀，牛晨启，邢新会，
申请(专利权)人：北京聚树生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：