一种检测目标蛋白分泌表达的方法及试剂盒技术

本申请提供一种检测目标蛋白分泌表达的方法，所述方法包括：将目标蛋白与荧光增强型纳米抗体融合得到融合蛋白，将得到的融合蛋白加入含有荧光蛋白和荧光抑制型纳米抗体的体系中进行反应，反应结束后测定体系的荧光强度，根据荧光强度的变化量来计算得到目标蛋白的分泌表达量。本申请利用GBP1与目标蛋白融合，并且通过加入连接肽减少其对目标蛋白的表达干扰，实现对目标蛋白的分泌表达量测定。本申请的方法可检测目标蛋白的浓度范围宽，信号响应倍数高，可应用于摇瓶、孔板和液滴微流控等筛选体系。等筛选体系。

【技术实现步骤摘要】
一种检测目标蛋白分泌表达的方法及试剂盒


[0001]本申请属于生物
，具体地，涉及一种检测目标蛋白分泌表达的方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]重组蛋白包括工业酶和医药蛋白等广泛应用于化工、食品及医药等行业，市场规模超过千亿元。为降低成本提高生产效率，常常需要通过优化表达系统来提高重组蛋白的分泌表达量。如利用物理或化学诱变技术，对宿主细胞进行诱变，产生全基因组随机突变文库，并对文库进行高通量筛选获得高产菌株。或使用代谢工程和合成生物学方法，优化表达元件和代谢途径等提高重组蛋白的分泌表达量。然而，上述操作均需要有对目标蛋白进行准确定量的方法。对于酶类重组蛋白，可以通过测定酶活力来检测其分泌表达量。而还有许多重组蛋白，如白蛋白、治疗性抗体及胶原蛋白等，不具有酶活性，因此需要开发其他非酶活依赖的简单快速的定量方法来检测其表达量，为通过高通量筛选等手段来优化重组蛋白分泌表达打下基础。
[0003]目前已经报道了非酶活力依赖的定量方法(参见Haitjema CH等人，ACS Synthetic Biology.2014 Feb 21；3(2):74
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82)，通过与目标蛋白融合半胱氨酸短肽标签(CCPGCC)Tc
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tag，此标签可以和双砷荧光探针(FlAsH
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EDT2)结合产生绿色荧光，并应用此系统在大肠杆菌中筛选高产分泌菌株。然而，由于双砷荧光探针(FlAsH
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EDT2)是小分子化合物，很容易通过细胞膜进入细胞内，与胞内的半胱氨酸短肽标签Tc
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tag结合产生荧光，无法与胞外的荧光信号进行区分，导致对目标蛋白的分泌表达量定量不准确。
[0004]还报道了另外一种定量方法(参见Knapp A等人.Journal of Biotechnology.2017 Sep 20；258:110
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116)，此系统使用拆分的绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)对目标蛋白进行定量，将目标蛋白与GFP的一个16氨基酸的片段(氨基酸215
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230，也称为GFP11)融合,同时独立表达制备所述GFP片段的互补片段(氨基酸1
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214，也称为GFP1
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10)。这两个片段在可溶状态下，可以自发折叠形成完整的GFP，并发出荧光，由此可以检测重组蛋白的分泌表达量。但由于GFP1
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10在大肠杆菌中表达以包涵体的形式存在，使得纯化制备GFP1
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10非常困难，只能通过尿素溶解包涵体的形式作为试剂使用。
[0005]纳米抗体是在骆驼外周血液中存在一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区。纳米抗体分子量小，不超过15KDa，易分泌表达，已经被证明可以在多种表达系统中分泌表达(大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、酵母、哺乳动物细胞等)，并且具有稳定性好、特异性高等优点，已经在生物技术研究和医疗诊断行业得到广泛关注。已有报道表明，抗GFP或eGFP的纳米抗体(GFP
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binding proteins，GBPs)，可以调节绿色荧光蛋白的亮度，如增强型纳米抗体GBP1可以特异性增强GFP的发光强度，而抑制型纳米抗体GBP4则特异性减弱GFP的发光强度(参见Kirchhofer A等人.Nature Structute&Molecular Biology.2010 Jan；17(1):133
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8)。

技术实现思路

[0006]针对现有技术存在的问题，本申请提供一种检测目标蛋白分泌表达的方法及试剂盒。
[0007]具体来说，本申请涉及如下方面：
[0008]1.一种检测目标蛋白分泌表达的方法，其特征在于，所述方法包括：
[0009]将目标蛋白与荧光增强型纳米抗体融合得到融合蛋白，
[0010]将得到的融合蛋白加入含有荧光蛋白和荧光抑制型纳米抗体的体系中进行反应，
[0011]反应结束后测定体系的荧光强度，
[0012]根据荧光强度的变化量来计算得到目标蛋白的分泌表达量。
[0013]2.根据项1所述的方法，其中，荧光蛋白和荧光抑制型纳米抗体的摩尔比为1:1。
[0014]3.根据项1所述的方法，其特征在于，所述荧光增强型纳米抗体为GBP1。
[0015]4.根据项1所述的方法，其特征在于，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白(GFP)、增强绿色荧光蛋白(eGFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、黄色荧光蛋白(YFP)或其他颜色的荧光蛋白。
[0016]5.根据项1所述的方法，其特征在于，所述荧光抑制型纳米抗体为GBP4
[0017]6.根据项1所述的方法，其特征在于，所述荧光蛋白在体系中的浓度为0.05
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50μM，优先为0.5
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5μM。
[0018]7.根据项1所述的方法，其特征在于，目标蛋白通过连接肽与荧光增强型纳米抗体融合得到融合蛋白。
[0019]8.根据项7所述的方法，其特征在于，所述连接肽的长度为1～100个氨基酸，优选为10个氨基酸，进一步优选所述氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0020]9.根据项1所述的方法，其特征在于，所述目标蛋白为50个
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1000个氨基酸的蛋白，
[0021]优选人血清白蛋白、牛血清白蛋白，免疫球蛋白、生长因子、抗原、或工业酶。
[0022]10.一种检测重组蛋白分泌表达的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括含有荧光蛋白和荧光抑制型纳米抗体的体系。
[0023]11.根据项10所述的试剂盒，其特征在于，绿色荧光蛋白(GFP)、增强绿色荧光蛋白(eGFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、黄色荧光蛋白(YFP)或其他颜色的荧光蛋白。
[0024]12.根据项10所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光抑制型纳米抗体为GBP4。
[0025]13.根据项10所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光蛋白和荧光抑制型纳米抗体的摩尔比为1:1，优选所述荧光蛋白在体系中的浓度为0.5
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2.5μM。
[0026]14.根据项10所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于构建包括目标蛋白、连接肽与荧光增强型纳米抗体的融合蛋白的试剂。
[0027]本申请利用GBP1与目标蛋白融合，并且通过加入连接肽减少其对目标蛋白的表达干扰，同时对GFP或eGFP和GBP4独立表达纯化制备成等摩尔量的混合物，通过添加此混合物到含GBP1标签的目标蛋白中，由于GBP1和GBP4竞争性与GFP或eGFP结合，最终GBP1替代GBP4使得GFP或eGFP重新产生荧光信号，从而实现对目标蛋白的分泌表达量的精准定量测定。此系统包含的荧光蛋白和纳米抗体均非常容易表达制备，且不易透过细胞膜进入细胞内。实验数据表明，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测目标蛋白分泌表达的方法，其特征在于，所述方法包括：将目标蛋白与荧光增强型纳米抗体融合得到融合蛋白，将得到的融合蛋白加入含有荧光蛋白和荧光抑制型纳米抗体的体系中进行反应，反应结束后测定体系的荧光强度，根据荧光强度的变化量来计算得到目标蛋白的分泌表达量。2.根据权利要求1所述的方法，其中，在体系中所述荧光蛋白和所述荧光抑制型纳米抗体的摩尔比为1:1，优选地，所述荧光增强型纳米抗体为GBP1，进一步优选地，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白(GFP)、增强绿色荧光蛋白(eGFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、黄色荧光蛋白(YFP)或其他颜色的荧光蛋白，更进一步优选地，所述荧光抑制型纳米抗体为GBP4。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光蛋白在体系中的浓度为0.05
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50μM，优选为0.5
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5μM。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，目标蛋白通过连接肽与荧光增强型纳米抗体融合得到融合蛋白。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述连接肽的长度为1
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100个氨基酸，优选为10个...

【专利技术属性】
技术研发人员：张翀，廖锡豪，邢新会，
申请(专利权)人：北京聚树生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：