一种RUNX2基因不表达的异种移植供体猪及制备方法技术

本发明专利技术提供一种RUNX2基因不表达的异种移植供体猪及其制备方法，RUNX2基因能引起异种免疫排斥风险，还利用CRISPR/Cas9系统敲除RUNX2基因，验证了RUNX2基因不表达可有效降低供体猪的器官、组织和/或细胞与接受者IgG和IgM的结合能力，提高供体猪的器官、组织和/或细胞抵抗接受者补体介导的细胞毒性的能力，可以延长供体猪的器官、组织和/或猪细胞接受者生存时间。生存时间。生存时间。

【技术实现步骤摘要】
一种RUNX2基因不表达的异种移植供体猪及制备方法


[0001]本申请属于动物基因工程领域，具体涉及一种RUNX2基因不表达的异种移植供体猪及制备方法。

技术介绍

[0002]来自不同物种供体的器官、组织和细胞的异种移植可以有效解决人供体的短缺。异种移植相对于自体移植、同种移植更有利之处包括在可预测的非紧急基础上供应、在控制环境中产生和可在移植前用于表征和研究。在诸多文献中得到证实在异种移植供体动物模型中，猪已成为异种移植领域中大多数研究的焦点，因为猪与人共享许多解剖和生理特征。猪也具有相对短的妊娠期，可以在无病原体环境中育种，并且可能不呈现与通常不用作食物来源的动物有关的相同伦理问题。
[0003]但目前的研究结果中，在将猪的器官移植到人体时会出现比自体移植、同种移植更加严重的多的免疫排斥反应，因为存在很多未知的引起免疫排斥的风险因子，影响猪的组织或器官植入后的长期存活，包括引起排斥反应的异源基因。
[0004]目前关于RUNX2基因研究如下：RUNX2(全称RUNX family transcription factor 2)转录因子，是高度保守的RUNX转录因子家族的成员。RUNX2主要在人类NK细胞分化过程中表达。RUNX2基因敲除抑制NK细胞发育，而过表达则加速成熟NK细胞的产生。RUNX2可能通过调节IL
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2Rβ表达调控人类NK细胞分化。RUNX2抑制细胞毒效应分子和细胞因子的表达，直接调控肿瘤坏死因子
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α及其效应分子。RUNX2敲除导致小鼠NK细胞数量显著减少。RUNX2在体内也是人类NK细胞发育所必需的。RUNX2与ETS1和T
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box因子合作，控制NK细胞的发育或功能过程。RUNX2在调节正常发育和肿瘤发生中起关键作用。RUNX2通过调节肿瘤代谢和白血病细胞迁移在人类T
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ALL(T细胞急性淋巴性白血病)高危亚型中起着依赖性因子的作用，是T
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ALL存活所必需的，其异常表达可增强疾病的播散。在功能上，RUNX2诱导CXCR4介导的T
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ALL细胞迁移。在更具侵袭性的癌细胞中，RUNX2能促进细胞分泌蛋白质的基因转录，这些蛋白质有助于重塑肿瘤周围的环境，使癌细胞更容易逃脱。RUNX2介导的变化发生在癌症进展和转移的晚期，主要的致癌作用已被描述为RUNX2在肿瘤发展中的作用。

技术实现思路

[0005]本专利技术研究发现RUNX2基因能引起异种免疫排斥风险，RUNX2基因不表达的可有效降低供体组织和/或器官细胞与接受者IgG和IgM的结合能力，提高供体组织和/或器官细胞抵抗接受者补体介导的细胞毒性的能力，可以延长供体组织和/或器在异种移植后的生存时间。根据上述本专利技术提供一种异种移植供体猪，所述的供体猪的器官、组织或细胞中RUNX2基因不表达，所述的接受者为人。
[0006]本专利技术所述的RUNX2基因不表达可以通过基因敲除、基因敲入、点突变；缺失突变以及它们的组合实现。
[0007]本专利技术所述的RUNX2基因不表达可以通过基因沉默实现。
[0008]本专利技术所述的基因敲除通过CRISPR
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Cas9基因敲除系统实现，所述的系统包括RUNX2基因敲除载体，包括载体一和载体二，所述的载体一连接有sgRN A1，所述的sgRNA1特异性靶向序列为AGCACTCCATACCTCTACTA；所述的载体二连接有sgRNA2，所述的sgRNA2特异性靶向序列为CAGCGTCAAC GCCATCATTC。
[0009]本专利技术所述的RUNX2基因敲除载体的构建方法：
[0010]合成所述的sgRNA1的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其互补链如SEQ ID NO.2所示，再将单链的sgRNA的DNA序列分别经过退火后形成sgRNA1寡核苷酸链；然后将该寡聚核苷酸连入PX330质粒载体中；
[0011]合成所述的sgRNA2的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其互补链如SEQ ID NO.4所示，再将单链的sgRNA的DNA序列分别经过退火后形成sgRNA2寡核苷酸链；然后将该寡聚核苷酸连入PX330质粒载体中。
[0012]本专利技术所述的RUNX2基因敲除载体导入转化细胞，所述的转化细胞用于制备异种移植用供体猪，所述的供体猪的器官、组织或细胞中RUNX2基因不表达。
[0013]本专利技术还提供一种异种移植供体制备方法，包括将所述的转化细胞移植到脱核的卵细胞来形成核移植卵，再将所述的核移植卵移植到代孕母的输卵管。
[0014]本专利技术还提供一种延迟、减少或防止人接受者中对异种移植器官或组织排斥、分离或不良反应的方法，所述的方法包括所述的方法包括对供体猪的组织或是器官的RUNX2基因进行遗传修饰，使供体猪或供体猪的组织、器官的RUNX2基因不表达。
[0015]本专利技术所述的异种移植供体的器官包括肝、肺、肾或皮肤。
[0016]本专利技术所述的异种移植供体的组织包括神经。
[0017]有益效果如下：
[0018]本专利技术首次发现RUNX2基因能引起异种免疫排斥风险，根据此提供一种异种移植供体，通过基因敲除或是基因沉默实现异种移植供体的RUNX2基因不表达，RUNX2基因不表达的可有效降低供体组织和/或器官细胞与人接受者IgG和IgM的结合能力，提高供体组织和/或器官细胞抵抗人接受者补体介导的细胞毒性的能力，可以延长供体组织和/或器在异种移植后的生存时间。
[0019]本专利技术利用CRISPR/Cas9系统设计双sgRNA敲除RUNX2基因，获得的基因敲除细胞系可作为体细胞核移植的供体，RUNX2敲除后可有效降低猪肾细胞与人IgG和IgM的结合能力，提高猪肾细胞抵抗人补体介导的细胞毒性的能力，并为深度挖掘RUNX2基因生物学功能提供有利的研究工具。
[0020]本专利技术所确定的风险因子RUNX2基因的敲除增加了异种细胞存活的机率，进一步提高了异种移植的可行性。
附图说明
[0021]图1为敲除RUNX2基因的阳性克隆细胞的鉴定图；
[0022]图2为野生猪肾细胞及RUNX2敲除的猪肾细胞在人血清孵育后的细胞存活情况图；
[0023]图3为野生猪肾细胞及RUNX2敲除的猪肾细胞与人IgG和IgM的结合能力检测图。
具体实施方式
[0024]通过以下实施例进一步举例描述本专利技术，并不以任何方式限制本专利技术，在不背离本专利技术的技术解决方案的前提下，对本专利技术所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本专利技术的权利要求范围之内。
[0025]实施例1、构建RUNX2基因敲除载体。
[0026]猪肾细胞RUNX2基因敲除利用CRISPR/Cas9系统实现，使用的sgRNA包括sgRNA1和sgRNA2。所述的sgRNA1的DNA序列如SEQ ID NO：1所示，互补链的DNA序列如SEQ ID NO：2所示；所述的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种异种移植供体猪，其特征在于，所述的供体猪的RUNX2基因不表达。2.如权利要求1所述的异种移植供体猪，其特征在于，所述的异种移植供体猪的器官、组织或细胞的接受者为人。3.如权利要求1所述的异种移植供体猪，其特征在于，所述的RUNX2基因不表达通过基因敲除、基因敲入、点突变、缺失突变以及它们的组合实现，或通过基因沉默实现。4.一种RUNX2基因敲除载体，其特征在于，所述的RUNX2基因敲除载体包括载体一和载体二：所述的载体一连接有sgRNA1，其特异性靶向序列为AGCACTCCATACCTCTACTA；所述的载体二连接有sgRNA2，其特异性靶向序列为CAGCGTCAACGCCATCATTC。5.一种转化细胞，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：欧阳红生，袁泓明，逄大欣，王子茹，
申请(专利权)人：吉林大学重庆研究院，
类型：发明
国别省市：