抗原特异性抗体的鉴定和产生制造技术

公开了一种从进行免疫接种的基因修饰的非人类哺乳动物获得编码对特定抗原具有特异性的抗体的免疫球蛋白可变结构域的核苷酸序列的方法。还公开了一种制造针对特定抗原的抗体的方法。体的方法。体的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抗原特异性抗体的鉴定和产生
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年9月11日提出的美国临时专利申请第63/077133号和2020年9月11日提出的美国临时专利申请第63/077140号的权益，两者的内容以引用的方式整体并入本文中。
专利

[0003]提供了用于获得编码对抗原具有特异性的抗体氨基酸序列，例如可变结构域氨基酸序列的核酸的方法。公开了如下方法，其包括从进行免疫接种的宿主获得编码来自第一样品的抗体序列和来自第二样品的针对所关注抗原的多种抗体的核酸序列，以获得编码对抗原具有特异性的人免疫球蛋白可变结构域或其部分的核苷酸序列。还公开了制造针对所关注抗原的抗体的方法。

技术介绍

[0004]抗体通常包含重链组分，其中每个重链单体与轻链缔合，这些链的可变结构域组合形成抗原结合位点。抗体，尤其是单克隆抗体，在诊断和治疗中具有广泛的用途。
[0005]两种传统的方法已用于制备单克隆抗体：杂交瘤技术和DNA展示(例如，在噬菌体、酵母或细菌系统中)。在杂交瘤技术中，来自免疫动物的B细胞通常与骨髓瘤细胞系融合，产生分泌抗原的杂交瘤系。分离产生所关注的单克隆抗体的细胞，在培养物中生长，并纯化所得到的所需抗体。高质量的纯化对于去除污染物来说至关重要。因此，由于杂交瘤培养的生产量有限，故通过杂交瘤技术分离抗体效率不高。
[0006]展示技术涉及从噬菌体、酵母或哺乳动物文库中产生先导候选抗体。虽然可利用从表达抗体的B细胞中直接分离DNA，但DNA文库在例如噬菌体、酵母或细菌系统的细胞表达系统中表达，然后“淘选”或滴定以选择具有高亲和力的抗体。展示技术可提供高质量的蛋白质文库，但它们提供的多样性有限。因此，基于体外诱变的亲和力成熟通常是产生源自这类文库的高亲和力抗体的下一步。
[0007]此外，抗体通常从血浆、血清、腹水、细胞培养基和细菌培养物中表达和分离。这些都是含有大量污染物的来源。因此，从这些来源中有效地纯化抗体是必要的。因此，所属领域仍然需要有效地产生和分离对靶抗原具有必需特异性和结合亲和力的抗体。

技术实现思路

[0008]本公开尤其描述了使用质谱法(“MS”)与下一代测序(“NGS”)的组合获得抗体的方法。还公开了制备抗体的方法。
[0009]所提供的方法能够有效地鉴定和/或选择抗体、尤其是来自已经用所关注的抗原进行免疫接种的宿主(例如，基因修饰的非人类动物，例如啮齿动物)的抗体的人免疫球蛋白可变结构域序列和/或互补决定区(CDR)序列。在一些实施方案中，所提供的方法包括将宿主的多个抗体序列(例如，由NGS产生的抗体序列的文库)与和/或针对来自宿主的抗体肽
的MS分析进行比较和/或询问的步骤。如本文使用的“数据库”可以是示例性“文库”。
[0010]在一些实施方案中，所提供的方法包括从用所关注的抗原进行免疫接种的宿主(例如从非人类动物，例如啮齿动物的B细胞)获得和/或产生多个免疫球蛋白可变结构域和/或CDR序列(例如文库)。在一些实施方案中，抗体序列的文库包含通过NGS获得的多个核酸序列。在一些实施方案中，抗体序列的文库包含多个CDR3序列。
[0011]在一些实施方案中，所提供的方法包括对从已经用所关注的抗原进行免疫接种的宿主(例如啮齿动物)获得的抗体样品的MS分析。本公开涵盖如下的认识，即，可在体内和/或离体针对期望特征对用于MS分析的抗体样品进行富集。举例来说，可基于体内定位富集抗体样品。因此，在一些实施方案中，抗体样品可以从宿主内的任何期望来源，例如血清、血浆、淋巴器官、肠、脑脊髓液、脑、脊髓、胎盘或它们的组合获得。在一些实施方案中，可离体针对一种或多种期望特征(例如抗原结合、与细胞的结合等)对抗体样品进行富集。本公开提供了如下的领悟：这类富集与所提供的方法组合使得能够鉴定出通过其它方法难以鉴定的抗体(例如因为以低滴度存在)。在一些实施方案中，本公开提供了一种获得对抗原具有特异性的抗体的人免疫球蛋白可变结构域或互补决定区(CDR)的方法。在一些实施方案中，本文所述的方法包括将来自第一样品的多个人免疫球蛋白可变结构域的氨基酸序列用来自第二样品的抗体群体的重链和/或轻链可变结构域的肽序列进行询问。在一些情况下，进行询问步骤由此获得对所述抗原具有特异性的抗体的人免疫球蛋白可变结构域或CDR序列。在一些实施方案中，询问包括将抗体群体的重链和/或轻链可变结构域的肽序列相互比对和与多个免疫球蛋白可变结构域的氨基酸序列进行比对。
[0012]在一些实施方案中，对抗原具有特异性的抗体的人免疫球蛋白可变结构域或CDR(例如CDR3)是从用特定抗原进行免疫接种的宿主获得的。在一些实施方案中，宿主是基因修饰的非人类哺乳动物。在一些实施方案中，宿主在其基因组，例如其种系基因组中包含免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含一个或多个人重链V基因区段(又称V
H
基因区段)、一个或多个人D基因区段(又称人D
H
基因区段)和一个或多个人重链J基因区段(又称人J
H
基因区段)。在一些实施方案中，重链可变区可操作地连接于恒定区(例如免疫球蛋白重链恒定区)。
[0013]在一些实施方案中，宿主在其基因组，例如其种系基因组中包含免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含一个或多个人轻链V基因区段(又称人V
L
基因区段)和一个或多个人轻链J基因区段(又称人J
L
基因区段)。在一些实施方案中，轻链可操作地连接于恒定区(例如免疫球蛋白轻链恒定区)。
[0014]在一些实施方案中，本文所述的方法包括从来自进行免疫接种的宿主的第一样品获得编码多个人免疫球蛋白可变结构域的多个核酸并确定编码的多个免疫球蛋白可变结构域的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述的方法包括从进行免疫接种的宿主获得包含针对所述抗原的抗体群体的第二样品并从其中确定抗体群体的重链和/或轻链可变结构域的肽序列。
[0015]在一些实施方案中，宿主是啮齿动物，例如大鼠或小鼠。
[0016]在一些实施方案中，本公开提供了一种鉴定对抗原具有特异性的抗体的人免疫球蛋白可变结构域或CDR序列(例如CDR3序列)的方法，所述方法包括：(i)获得或确定从样品获得的人免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域的多个肽序列，所述样品包含由用所述抗
原进行免疫接种的啮齿动物产生的抗体群体，和(ii)将人免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域序列的文库用通过MS确定的所述多个肽序列进行询问，其中所述文库包含由所述免疫啮齿动物的B细胞编码的多个人免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域序列，由此获得对所述抗原具有特异性的抗体的人免疫球蛋白可变结构域或CDR序列。
[0017]在一些实施方案中，本公开提供了一种鉴定对抗原具有特异性的抗体的人免疫球蛋白可变结构域或CDR序列(例如CDR3序列)的方法，所述方法包括：(i)获得人免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域序列的文库，所述文库包含由用所述抗原进行免疫接种的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种鉴定对抗原具有特异性的抗体的人免疫球蛋白可变结构域或CDR序列的方法，所述方法包括：获得从样品获得的人免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域的多个肽序列，所述样品包含由用所述抗原进行免疫接种的啮齿动物产生的抗体群体，和将人免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域序列的文库用所述多个肽序列进行询问，其中所述文库包含由所述进行免疫接种的啮齿动物的B细胞编码的多个人免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域序列，由此获得对所述抗原具有特异性的抗体的人免疫球蛋白可变结构域或CDR序列，并且其中所述进行免疫接种的啮齿动物在其种系基因组中包含：免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含一个或多个人重链V基因区段、一个或多个人D基因区段和一个或多个人重链J基因区段，其中所述重链可变区可操作地连接于恒定区，和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含一个或多个人轻链V基因区段和一个或多个人轻链J基因区段，其中所述轻链可操作地连接于恒定区。2.一种鉴定对抗原具有特异性的抗体的人免疫球蛋白可变结构域或CDR序列的方法，所述方法包括：获得人免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域序列的文库，所述文库包含由用所述抗原进行免疫接种的啮齿动物的B细胞编码的多个人免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域序列，将所述文库用从样品获得的人免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域的多个肽序列进行询问，所述样品包含由用所述抗原进行免疫接种的所述啮齿动物产生的抗体群体，并且其中所述进行免疫接种的啮齿动物在其种系基因组中包含：免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含一个或多个人重链V基因区段、一个或多个人D基因区段和一个或多个人重链J基因区段，其中所述重链可变区可操作地连接于鼠恒定区，和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含一个或多个人轻链V基因区段和一个或多个人轻链J基因区段，其中所述轻链可操作地连接于鼠恒定区。3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述文库的所述多个人免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域序列通过对包含来自所述啮齿动物的骨髓和/或脾的B细胞群体的样品进行测序来获得。4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述文库的所述多个人免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域序列通过对包含重排重链VDJ序列和/或重排轻链VJ序列的cDNA进行测序来获得。5.如权利要求4所述的方法，其中所述测序通过下一代DNA测序进行。6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中包含由用所述抗原进行免疫接种的所述啮齿动物产生的抗体群体的所述样品源自于所述啮齿动物的血清、血浆、淋巴器官、肠、脑脊髓液、脑、脊髓和/或胎盘。7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中人免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域的所述多个肽序列通过质谱法(MS)获得或确定。
8.如权利要求7所述的方法，其中人免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域的所述多个肽序列通过组合的液相色谱法与质谱法(LC
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MS)获得或确定。9.如权利要求7或8所述的方法，其中在MS分析之前使包含由用所述抗原进行免疫接种的所述啮齿动物产生的抗体群体的所述样品变性。10.如权利要求7至9中任一项所述的方法，其中在MS分析之前对包含由用所述抗原进行免疫接种的所述啮齿动物产生的抗体群体的所述样品进行蛋白水解消化。11.如权利要求7至10中任一项所述的方法，其中在MS分析之前针对一种或多种特征对包含由用所述抗原进行免疫接种的所述啮齿动物产生的抗体群体的所述样品进行富集。12.如权利要求11所述的方法，其中使包含由用所述抗原进行免疫接种的所述啮齿动物产生的抗体群体的所述样品富集结合所述抗原的抗体。13.如权利要求12所述的方法，其中使包含由用所述抗原进行免疫接种的所述啮齿动物产生的抗体群体的所述样品耗竭结合第二不同抗原的抗体。14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述人免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域序列的文库用所述多个肽序列进行询问包括将所述肽序列相互比对并与所述多个人免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域的氨基酸序列进行比对。15.如权利要求7至14中任一项所述的方法，其中所述文库是人免疫球蛋白重链可变结构域序列的文库并且用所述多个肽序列进行的所述询问基于以下中的一者或多者：(1)所述人免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域序列的文库中的CDR3序列与通过MS获得或确定的独特肽匹配，(2)所述人免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域序列的文库中的独特CDR1和/或CDR2序列与通过MS获得或确定的一种或多种独特肽匹配，(3)所述人免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域序列的文库中的一个或多个框架序列与通过MS获得或确定的一种或多种独特肽匹配，(4)所述人免疫球蛋白重链和/或轻链可变结构域序列的文库中的序列的大量下一代测序计数，(5)排除具有甲硫氨酸的CDR序列，以及(6)排除具有潜在N糖基化的CDR序列。16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中询问所述文库鉴定出对所述抗原具有特异性的抗体的多个人免疫球蛋白可变结构域或CDR序列，并且其中对所述多个人免疫球蛋白可变结构域或CDR序列进行排序。17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物是大鼠。18.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述啮齿动物是小鼠。19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述免疫球蛋白重链可变区可操作地连接于小鼠重链恒定区，和/或所述免疫球蛋白轻链可...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘亚孰，郭春光，章乾，娜塔莎，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：