包含脂质运载蛋白突变蛋白的双特异性抗原结合分子制造技术

本发明专利技术涉及能够二价结合到4

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含脂质运载蛋白突变蛋白的双特异性抗原结合分子


[0001]本专利技术涉及能够二价结合到4
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1BB并单价结合到靶细胞抗原的双特异性抗原结合分子及其在治疗癌症或感染性疾病中的用途，所述双特异性抗原结合分子包含两个(两种)能够特异性结合到4
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1BB的脂质运载蛋白突变蛋白。本专利技术进一步涉及生产这些分子的方法和使用它们的方法。

技术介绍

[0002]4‑
1BB(CD137)是TNF受体超家族的成员，其最先被鉴定为由T细胞活化表达的诱导型分子(Kwon和Weissman,1989,Proc Natl Acad Sci USA 86,1963
‑
1967)。随后的研究表明，许多其他免疫细胞也表达4
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1BB，包括NK细胞、B细胞、NKT细胞、单核细胞、中性粒细胞、肥大细胞、树突细胞(DC)和非造血来源的细胞，诸如内皮细胞和平滑肌细胞(Vinay和Kwon,2011,Cell Mol Immunol 8,281
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284)。4
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1BB在不同细胞类型中的表达大多数是可诱导的，并且受各种刺激信号(诸如T细胞受体(TCR)或B细胞受体触发以及通过共刺激分子或促炎细胞因子的受体诱导的信号传导)驱动(Diehl等人，2002,J Immunol 168,3755
‑
3762；Zhang等人，2010,Clin Cancer Res 13,2758
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2767)。
[0003]1993年鉴定出了4
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1BB配体(4
‑
1BBL或CD137L)(Goodwin等人，1993，Eur J Immunol 23,2631
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2641)。已经表明，4
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1BBL的表达仅限于专职抗原呈递细胞(APC)诸如B细胞、DC和巨噬细胞上。4
‑
1BBL的可诱导表达是T细胞(包括αβ和γδ两种T细胞亚群)和内皮细胞的特征(Shao和Schwarz,2011,J Leukoc Biol 89,21
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29)。
[0004]通过4
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1BB受体的共刺激(例如通过4
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1BBL连接)活化了T细胞(CD4
+
和CD8
+
亚群两者)内的多个信号传导级联，有力地增强了T细胞的活化(Bartkowiak和Curran,2015,Front Oncol 5,117)。与TCR触发相结合，激动性4
‑
1BB特异性抗体增强T细胞增殖、刺激淋巴因子分泌并且降低T淋巴细胞对活化诱导的细胞死亡的敏感性(Snell等人,2011,Immunol Rev 244,197
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217)。这种机制被进一步推进，作为癌症免疫疗法概念的第一个证明。在对荷瘤小鼠施用抗4
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1BB的激动性抗体的临床前模型中，产生了有效的抗肿瘤作用(Melero等人，1997，Nat Med 3,682
‑
685)。后来，越来越多的证据表明，4
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1BB通常只有在与其他免疫调节化合物、化学治疗剂、肿瘤特异性疫苗接种或放射疗法组合施用时才能表现出其作为抗肿瘤剂的效力(Bartkowiak和Curran，2015，Front Oncol 5,117)。
[0005]TNFR超家族的信号传导需要三聚配体的交联以与受体接合，需要野生型Fc结合的4
‑
1BB激动性抗体也是如此(Li和Ravetch,2011,Science333,1030
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1034)。但是，全身施用具有功能活性Fc结构域的4
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1BB特异性激动性抗体导致与肝毒性相关联的CD8
+ T细胞的流入(Dubrot等人,2010,Cancer Immunol Immunother 59,1223
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1233)，所述肝毒性在小鼠体内不存在功能性Fc受体的情况下减弱或明显改善。在临床中，Fc感受态4
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1BB激动性Ab(BMS
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663513)(NCT00612664)引起4级肝炎，导致试验终止(Simeone和Ascierto,2012,J Immunotoxicol 9,241
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247)。因此，需要有效且更安全的4
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1BB激动剂。
[0006]人成纤维细胞活化蛋白(FAP；GenBank登录号AAC51668)，也称为Seprase，是一种
170kDa的整合膜丝氨酸肽酶(EC 3.4.21.B28)。FAP与二肽基肽酶IV(也称为CD26；GenBank登录号P27487)(一种密切相关的细胞表面酶)和其他肽酶一起属于二肽基肽酶IV家族(Yu等人，FEBS J 277,1126
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1144(2010))。它是一种含有两个N
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糖基化亚基的同二聚体，具有一个大的C末端胞外域，酶的催化域位于其中(Scanlan等人，Proc Natl Acad Sci USA 91,5657
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5661(1994))。FAP处于其糖基化形式，具有后脯氨酰二肽基肽酶和明胶酶活性两者(Sun等人，Protein Expr Purif 24,274
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281(2002))。由于其在许多常见癌症中的表达及其在正常组织中的有限表达，FAP已经被认为是用于多种癌症的成像、诊断和治疗的有希望的抗原靶点。因此，已经针对FAP产生(raised，提出)了多种单克隆抗体，用于研究、诊断和治疗目的。
[0007]人表皮生长因子受体
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2(HER2；ErbB2)是一种受体酪氨酸激酶，并且是跨膜受体的表皮生长因子受体(EGFR)家族的成员。HER2在一系列肿瘤类型中过表达，并与疾病的发生和进展相关。它与预后不良有关。例如，在大约30％的人类乳腺癌中观察到HER2的过表达，并且其同与这些肿瘤相关的侵袭性生长和不良的临床结果相关(Slamon等人，(1987)Science 235:177
‑
182)。
[0008]人源化抗HER2单克隆抗体曲妥珠单抗(CAS 180288
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69
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1、huMAb4D5
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8、rhuMAb HER2，基因泰克)靶向HER2的胞外域(US 5677171；US 5821337；US 6054297；US 6165464；US 6339142；US 6407213；US 6639055；US 6719971；US 6800738；US 7074404；Coussens等人，(1985)Science 230:1 132
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9；Slamon等人，(1989)Science 244:707
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12；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种能够二价结合到4
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1BB并单价结合到靶细胞抗原的双特异性抗原结合分子，其包含(a)能够特异性结合到靶细胞抗原的抗原结合结构域，(b)Fc结构域，其包括能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基，以及(c)两个能够特异性结合到4
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1BB的脂质运载蛋白突变蛋白，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白中的一个与所述Fc结构域的所述第一亚基的C末端融合，并且另一个与所述Fc结构域的所述第二亚基的C末端融合。2.根据权利要求1所述的双特异性抗原结合分子，其中所述能够特异性结合到4
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1BB的脂质运载蛋白突变蛋白中的每一个均源自SEQ ID NO:1的成熟人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(huNGAL)。3.根据权利要求1或2所述的双特异性抗原结合分子，其中所述能够特异性结合到4
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1BB的脂质运载蛋白突变蛋白中的每一个均包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或SEQ ID NO:2的氨基酸序列，其中以下氨基酸中的一个或多个按如下突变：(a)位置20处的Q被R替换，或(b)位置25处的N被Y或D替换，或(c)位置28处的H被Q替换，或(d)位置36处的Q被M替换，或(e)位置40处的I被N替换，或(f)位置41处的R被L或K替换，或(g)位置44处的E被V或D替换，或(h)位置46处的K被S替换，并且位置47至49处的氨基酸被缺失，或(i)位置49处的I被H、N、V或S替换，或(j)位置52处的M被S或G替换，或(k)位置59处的K被N替换，或(l)位置65处的D被N替换，或(m)位置68处的M被D、G或A替换，或(n)位置70处的K被M、T、A或S替换，或(o)位置71处的F被L替换，或(p)位置72处的D被L替换，或(q)位置77处的M被Q、H、T、R或N替换，或(s)位置79处的D被I或A替换，或(t)位置80处的I被N替换，或(u)位置81处的W被Q、S或M替换，或(v)位置82处的T被P替换，或(w)位置83处的F被L替换，或(y)位置92处的F被L或S替换，或(z)位置94处的L被F替换，或(za)位置96处的K被F替换，或(zb)位置100处的F被D替换，或
(zc)位置101处的P被L替换，或(zd)位置103处的H被P替换，或(ze)位置106处的S被Y替换，或(zf)位置122处的F被Y替换，或(zg)位置125处的F被S替换，或(zh)位置127处的F被I替换，或(zi)位置132处的E被W替换，或(zj)位置134处的Y被G替换。4.根据权利要求1至3中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述能够特异性结合到4
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1BB的脂质运载蛋白突变蛋白中的每一个均包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20。5.根据权利要求1至4中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述能够特异性结合到4
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1BB的脂质运载蛋白突变蛋白中的每一个均包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。6.根据权利要求1至5中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述Fc结构域包含促进所述Fc结构域的所述第一亚基和所述第二亚基的缔合的杵臼修饰。7.根据权利要求1至6中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述Fc结构域包含一个或多个降低与Fc受体、特别是与Fcγ受体的结合的氨基酸取代。8.根据权利要求1至7中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述Fc结构域是IgG1 Fc结构域，其包含氨基酸取代氨基酸取代L234A、L235A和P329G(根据Kabat的EU编号)。9.根据权利要求1至8中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述能够特异性结合到靶细胞抗原的抗原结合结构域是能够特异性结合到靶细胞抗原的Fab片段。10.根据权利要求1至9中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述能够特异性结合到靶细胞抗原的Fab片段是能够特异性结合到成纤维细胞活化蛋白(FAP)的Fab片段。11.根据权利要求1至10中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述能够特异性结合到成纤维细胞活化蛋白(FAP)的Fab片段包含：(a)重链可变区(V
H
FAP)，其包含：(i)CDR
‑
H1，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，(ii)CDR
‑
H2，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，和(iii)CDR
‑
H3，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；以及轻链可变区(V
L
FAP)，其包含：(iv)CDR
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L1，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，(v)CDR
‑
L2，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，和(vi)CDR
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L3，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；或者(b)重链可变区(V
H
FAP)，其包含：(i)CDR
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H1，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，(ii)CDR
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H2，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，和(iii)CDR
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H3，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；以及轻链可变区(V
L
FAP)，其包含：(iv)CDR
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L1，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，(v)CDR
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L2，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，和(vi)CDR
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L3，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述能够特异性结合到成纤维细胞活化蛋白(FAP)的Fab片段包含：(a)重链可变区(V
H
FAP)，其包含与SEQ ID NO:27的氨基酸序列至少约95％...

【专利技术属性】
技术研发人员：C，
申请(专利权)人：豪夫迈，
类型：发明
国别省市：