一种R-氰醇裂解酶的制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种新型的、来源于芒果的R

【技术实现步骤摘要】
一种R
‑
氰醇裂解酶的制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种R
‑
氰醇裂解酶的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]手性氰醇(酯)是一类在工业不对称合成生产中具有重要地位的手性原料，同时，它能很容易地转化为手性α
‑
羟基酸(酯)、α
‑
氨基酸、β
‑
氨基醇等具有重要商业价值的医药和农药中间体，因此，手性氰醇的合成一直是学术界和工业界的关注热点之一。手性氰醇的合成有一定的难度和挑战性，其不对称合成需要使用手性化学或者生物催化剂，其中生物催化剂(氰醇酶)由于来源丰富、成本低廉、催化效率高、反应条件温和、产率和光学纯度高、底物适用范围广等特点，而远远优于化学催化剂，被广泛使用在有机合成工业中。
[0003]氰醇(裂解)酶催化HCN与醛酮的加成，生成α
‑
手性氰醇产物。天然的R
‑
氰醇酶存在于蔷薇科李属植物及一些水果中，目前只有来源于蔷薇科植物的才是工业化应用成功的案例，比如Prunus amygdalus(Pa HNL)、Prunus domestica(Pd HNL)或者Prunus mume(Pm HNL)等，其中又以Prunus amygdalus(Pa HNL)的氰醇裂解酶为主，所以寻找其它来源的氰醇酶，并且将其应用到手性氰醇的工业化生产中，具有很重要的实际意义。

技术实现思路

[0004]本部分的目的在于概述本专利技术的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和专利技术名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和专利技术名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本专利技术的范围。
[0005]鉴于上述和/或现有R
‑
氰醇裂解酶制备方法中存在的问题，提出了本专利技术。
[0006]因此，本专利技术其中一个目的是，提供一种R
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氰醇裂解酶的制备方法及其应用。
[0007]为解决上述技术问题，根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了如下技术方案：一种R
‑
氰醇裂解酶的制备方法，包括，
[0008]R
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氰醇裂解酶野生型基因进行突变处理：将R
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氰醇裂解酶基因，氰醇裂解酶的野生型基因序列如Seq ID No.1所示进行突变处理，处理后得到氰醇裂解酶突变子基因，氰醇裂解酶突变子基因序列如Seq ID No.2所示；
[0009]添加酶切位点：向氰醇裂解酶突变子基因中插入双酶切位点；
[0010]制备重组质粒：将氰醇裂解酶突变子基因插入到表达载体中得到重组质粒；
[0011]导入菌株：将带有氰醇裂解酶基因的重组质粒导入到菌株中得到重组表达菌株；
[0012]菌株的分泌和表达：将重组表达菌株在培养液中诱导表达然后收集酶液。
[0013]作为本专利技术所述R
‑
氰醇裂解酶的制备方法的一种优选方案，其中：所述突变处理的方式为易错PCR。
[0014]作为本专利技术所述R
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氰醇裂解酶的制备方法的一种优选方案，其中：所述添加酶切位点中，双酶切位点为NdeI/HindIII。
[0015]作为本专利技术所述R
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氰醇裂解酶的制备方法的一种优选方案，其中：所述制备重组
质粒中，表达载体为pET26b(+)，其N端包含信号肽pelB leader。
[0016]作为本专利技术所述R
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氰醇裂解酶的制备方法的一种优选方案，其中：所述导入菌株中，所述菌株为E.coli BL21(DE3)。
[0017]作为本专利技术所述R
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氰醇裂解酶的制备方法的一种优选方案，其中：所述菌株的分泌和表达中，所述培养液为LB培养基。
[0018]作为本专利技术所述R
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氰醇裂解酶的制备方法的一种优选方案，其中：所述菌株的分泌和表达中，还包括诱导培养，当培养基中OD
600
＝1.0后，加入0.2mM IPTG并且保持温度为30℃，诱导表达4～5h。
[0019]作为本专利技术所述R
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氰醇裂解酶的制备方法所得到产品的应用，其中：所述应用，包括，
[0020]将底物溶解于叔丁基甲醚(MTBE)中，得到底物的MTBE溶液；将所得到的产品稀释在磷酸盐
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柠檬酸缓冲液中，并调节pH到3.4，得到酶液；将上述底物的MTBE溶液和酶液充分混合，使体系降温到10℃，搅拌成乳浊液后，加入液体氢氰酸反应得到R
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苯乙氰醇和R
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邻甲基苯乙氰醇。
[0021]作为本专利技术所述R
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氰醇裂解酶的制备方法所得到产品的应用，其中：所述底物为苯乙氰醇和/或邻甲基苯乙氰醇中的一种或两种；所述底物的MTBE溶液浓度为8微升每毫升缓冲液；所述底物的MTBE溶液与酶液的体积比为2：1.2～1.7；所述液体氢氰酸的添加量与底物的MTBE溶液与酶液的总体积比为4～3.5：1.2。
[0022]作为本专利技术所述R
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氰醇裂解酶的制备方法所制得产品，其中：所述产品，其R
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苯乙氰醇和R
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邻甲基苯乙氰醇收率均≥95％，手性值(e.e值)均≥99.5％。
[0023]本专利技术的有益效果：
[0024]本专利技术提供了一种新型的、来源于芒果的R
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氰醇裂解酶的制备方法及其应用。具体地，通过构建随机突变和点饱和突变文库，以及高通量筛选获得多种突变的氰醇裂解酶，合成得到的R
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苯乙氰醇和R
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邻甲基苯乙氰醇收率均≥99.5％，手性值(e.e值)均≥99.5％。其方法安全、简单且易于操作。
具体实施方式
[0025]为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本专利技术的具体实施方式做详细的说明。
[0026]在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术，但是本专利技术还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本专利技术内涵的情况下做类似推广，因此本专利技术不受下面公开的具体实施例的限制。
[0027]其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本专利技术至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
[0028]本专利技术的实施例中，采用来源于芒果(Mangifera indica)的R
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选择性氰醇裂解酶。
[0029]本专利技术中所用叔丁基甲醚与液体氢氰酸均为分析纯，其他原料和试剂，若无特殊说明，均为市售。
[0030]实施例1
[0031]本专利技术设计的具体原理为通过构建本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种R
‑
氰醇裂解酶的制备方法，其特征在于：包括，R
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氰醇裂解酶野生型基因进行突变处理：将R
‑
氰醇裂解酶基因，氰醇裂解酶的野生型基因序列如Seq ID No.1所示进行突变处理，处理后得到氰醇裂解酶突变子基因，氰醇裂解酶突变子基因序列如Seq ID No.2所示；添加酶切位点：向氰醇裂解酶突变子基因中插入双酶切位点；制备重组质粒：将氰醇裂解酶突变子基因插入到表达载体中得到重组质粒；导入菌株：将带有氰醇裂解酶基因的重组质粒导入到菌株中得到重组表达菌株；菌株的分泌和表达：添加信号肽，将重组表达菌株在培养液中诱导表达然后收集酶液。2.如权利要求1所述R
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氰醇裂解酶的制备方法，其特征在于：所述突变处理的方式为易错PCR。3.如权利要求1所述R
‑
氰醇裂解酶的制备方法，其特征在于：所述添加酶切位点中，双酶切位点为NdeI/HindIII。4.如权利要求1所述R
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氰醇裂解酶的制备方法，其特征在于：所述制备重组质粒中，表达载体为pET26b(+)，其N端为信号肽pelB leader，信号肽的基因序列如Seq ID No.5所示。5.如权利要求1所述R
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氰醇裂解酶的制备方法，其特征在于：所述导入菌株中，所述菌株为E.coli BL21(DE3)。6.根据权利要求1所述R
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氰醇裂解酶的制备方法，其特征在于：所述菌株的分泌和表达中，所述培养液为LB培养基。7.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹金辉，宗匡，喻海亮，曾鹏，刘建明，陈文欢，
申请(专利权)人：江西科苑生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：