一种S-氰醇裂解酶的制备方法及其产品技术

本发明专利技术提供了一种植物来源的、新型的S

【技术实现步骤摘要】
一种S
‑
氰醇裂解酶的制备方法及其产品


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种S
‑
氰醇裂解酶的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]氰醇裂解酶是一种在化工生产中非常有用的工业用酶，其天然活性是催化氰醇的裂解并释放出氢氰酸。氰醇裂解酶可以催化逆反应，即HCN与醛酮的加成，得到具有光学活性的α
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氰醇产物。
[0003]天然的S
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氰醇裂解酶存在于橡胶、木薯和高粱等少数几种植物组织中，丰度低，纯化难度大。1995年，Wajant采用五步纯化法从木薯中分离得到了木薯氰醇裂解酶MeHNL(Plant Sci，1995，108，1)；White等人采用三步法从木薯叶中提取了MeHNL，采用盐析和透析的方式得到了酶液，但是应用于化学催化的立体选择性不高(Plant Physiol 1998，116，1219)。来源于木薯(Manihot esculenta)的氰醇裂解酶(MeHNL)是一种S
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氰醇裂解酶，己有文献报道将MeHNL用于催化S
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型手性氰醇的化学合成，ee值＞99％，具有重要的应用价值，例如S
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间苯氧基苯甲醛氰醇是新型菊酯类农药的通用中间体。1993年，Wajant等人报道了编码MeHNL的cDNA序列和蛋白序列。
[0004]采用微生物作为宿主菌是快速大量的得到氰醇裂解酶的有效方法。Effenberger等人在1996年报道了MeHNL在大肠杆菌中的重组表达，但是蛋白多为包涵体，可溶性蛋白含量较低(Angew 1996，35，437)。程树华等2001年将MeHNL基因克隆到质粒PPIC9K中，实现了在酵母菌中的表达(生物工程学报，2001，17(1)，78)，但是酶活仍然不够高，难以达到实际应用的要求。

技术实现思路

[0005]本部分的目的在于概述本专利技术的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和专利技术名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和专利技术名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本专利技术的范围。
[0006]鉴于上述和/或现有S
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氰醇裂解酶制备方法中存在的问题，提出了本专利技术。
[0007]因此，本专利技术其中一个目的是，克服现有制备的S
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氰醇裂解酶活性不够高的缺陷，提供一种S
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氰醇裂解酶的制备方法及其应用。
[0008]为解决上述技术问题，根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了如下技术方案：一种S
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氰醇裂解酶的制备方法，包括，
[0009]氰醇裂解酶野生型基因进行突变处理：将氰醇裂解酶基因，氰醇裂解酶的野生型基因序列如Seq ID No.1所示进行突变处理，处理后得到氰醇裂解酶突变子基因，氰醇裂解酶突变子基因序列如Seq ID No.2所示。
[0010]添加酶切位点：向氰醇裂解酶突变子基因中插入双酶切位点；
[0011]制备重组质粒：将氰醇裂解酶突变子基因插入到表达载体中得到重组质粒；
[0012]导入菌株：将带有氰醇裂解酶基因的重组质粒导入到菌株中得到重组表达菌株；
[0013]菌株的分泌和表达：将重组表达菌株在培养液中诱导表达然后收集酶液。
[0014]作为本专利技术所述S
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氰醇裂解酶的制备方法的一种优选方案，其中：所述突变处理，其中，突变处理的方式为易错PCR。
[0015]作为本专利技术所述S
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氰醇裂解酶的制备方法的一种优选方案，其中：所述添加酶切位点中，双酶切位点为NdeI/HindIII。
[0016]作为本专利技术所述S
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氰醇裂解酶的制备方法的一种优选方案，其中：所述制备重组质粒中，表达载体为pET26b(+)。
[0017]作为本专利技术所述S
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氰醇裂解酶的制备方法的一种优选方案，其中：所述导入菌株中，所述菌株为E.coli BL21(DE3)。
[0018]作为本专利技术所述S
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氰醇裂解酶的制备方法的一种优选方案，其中：所述菌株的分泌和表达中，还包括诱导培养，当培养基中OD
600
＝1.0后，加入0.2mM IPTG并且保持温度为30℃，诱导表达4～5h。
[0019]作为本专利技术所述S
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氰醇裂解酶的制备方法所制得产品，其中：所述产品，其催化活性是野生型氰醇裂解酶的200％～500％倍。
[0020]本专利技术的有益效果：
[0021]本专利技术提供了一种植物来源的、新型的S
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氰醇裂解酶突变子的制备方法及其应用。具体地，通过通过构建随机突变和点饱和突变文库，以及高通量筛选获得多种突变的氰醇裂解酶，上述氰醇裂解酶突变子的催化活性是野生型的氰醇裂解酶的200％～500％。
具体实施方式
[0022]为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本专利技术的具体实施方式做详细的说明。
[0023]在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术，但是本专利技术还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本专利技术内涵的情况下做类似推广，因此本专利技术不受下面公开的具体实施例的限制。
[0024]其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本专利技术至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
[0025]本专利技术的实施例中，所用氰醇裂解酶为木薯氰醇裂解酶。
[0026]本专利技术中所用原料和试剂，若无特殊说明，均为市售。
[0027]实施例1
[0028]本专利技术设计的具体原理为通过构建随机突变和点饱和突变文库，以及高通量筛选获得多种突变的氰醇裂解酶。
[0029]S
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氰醇裂解酶突变子来源为野生型氰醇裂解酶，其具体的合成方法为：将氰醇裂解酶野生基因如Seq ID No.1所示，或者将氰醇裂解酶突变子基因如Seq ID No.2所示，两端加入酶切位点NdeI和HindIII，DNA酶切纯化后插入到表达载体pET26b(+)中得到重组质粒，将重组质粒转化入E.coliBL21(DE3)中构建成重组表达菌株。上述重组菌株在LB培养基中培养到OD
600
＝1.0后，0.2mM IPTG并在30℃诱导培养4～5小时，离心收集得到野生型或者突变子细胞，细胞超声裂解后得到粗酶液。
[0030]实施例2
[0031]野生型氰醇裂解酶突变子的制备方法如下：
[0032]将木薯(Manihot esculenta)的氰醇裂解酶野生基因序列如Seq ID No.1所示，通过易错PCR的方式导入随机突变和(或者)基于本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种S
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氰醇裂解酶的制备方法，其特征在于：包括，氰醇裂解酶野生型基因进行突变处理：将氰醇裂解酶基因，氰醇裂解酶的野生型基因序列如Seq ID No.1所示进行突变处理，处理后得到氰醇裂解酶突变子基因，氰醇裂解酶突变子基因序列如Seq ID No.2所示；添加酶切位点：向氰醇裂解酶突变子基因中插入双酶切位点；制备重组质粒：将氰醇裂解酶突变子基因插入到表达载体中得到重组质粒；导入菌株：将带有氰醇裂解酶基因的重组质粒导入到菌株中得到重组表达菌株；菌株的分泌和表达：将重组表达菌株在培养液中诱导表达然后收集酶液。2.如权利要求1所述S
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氰醇裂解酶的制备方法，其特征在于：所述突变处理，其中，突变处理的方式为易错PCR。3.如权利要求1所述S
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氰醇裂解酶的制备方法，其特征在于：所...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹金辉，宗匡，喻海亮，曾鹏，刘建明，陈文欢，
申请(专利权)人：江西科苑生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：