胡椒PNPAL3基因及其在胡椒抗瘟病中的应用制造技术

本发明专利技术属于植物基因工程技术领域，具体公开了一种胡椒PNPAL3基因，核苷酸序列为SEQ ID NO:1。本发明专利技术还公开了上述胡椒PNPAL3基因在胡椒抗瘟病中的应用。本发明专利技术公开的胡椒PNPAL3基因能够提高热引1号抗瘟病能力；对PnPAL3基因进行烟草转化，得到木质素总含量升高、G型木质素含量升高、抗病性明显提高的转基因烟草植株。株。株。

【技术实现步骤摘要】
胡椒PNPAL3基因及其在胡椒抗瘟病中的应用


[0001]本专利技术属于植物基因工程
，尤其涉及一种胡椒PNPAL3基因及其在胡椒抗瘟病中的应用。

技术介绍

[0002]胡椒(Piper nigrum L.)果实具有又香又辛辣的独特风味，素有“香料之王”的美誉，是世界最重要的香辛料作物，深受人们喜爱，与人类舌尖上的体验和生命健康密切相关。胡椒已有4000多年的栽培利用历史，原产于印度，目前广泛种植于热带、亚热带等30多个国家地区。从古代上流阶层的奢侈品到现在家喻户晓的重要调味品，胡椒演绎着各种传奇的故事，曾是受到世界广泛认可的“硬通货”，十字军东征、大航海时代等重要历史事件都或多或少与人类对胡椒的向往有关。
[0003]“热引1号”胡椒(P.nigrum c.v.Reyin
‑
1)是由专利技术人单位选育的胡椒主栽品种，具有产量高、品质优的特点，商品白胡椒平均产量200千克/亩、胡椒碱含量4.50％，推广面积占全国90％以上，但该品种与国际现有主推品种一样高感胡椒瘟病
‑
由辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leon)引起的一种气候依赖型、传染力很强的土传性病害，可导致严重减产甚至死亡。胡椒主栽品种抗瘟病能力差，已成为限制包括我国在内的世界胡椒产业健康发展的“卡脖子”问题，胡椒抗瘟病品种的创制越来越受到国际育种学家的重视。有研究发现胡椒木质素积累可能是产生抗性的原因，并且差异表达基因均与木质素合成有关。
[0004]苯丙氨酸解氨酶(PAL,phenylalanine ammonia
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lyase)是苯丙烷途径的入口酶和限速酶，是与植物抗病性相关的关键酶，与植物抗毒性及酚类化合物的形成密切相关。苯丙烷代谢途径参与胡椒抗瘟病反应，基于玉米和拟南芥等作物的研究显示：超表达PNPAL基因可以提高作物抵抗病原菌(PlantAugust 2010,Vol.153,pp,1526
‑
1538)，然而胡椒中苯丙氨酸解氨酶基因在胡椒抗瘟病中的作用还未见报道。
[0005]在植物体中，木质素不仅参与植物体内管状分子(如导管或管胞)的形成及细胞的分化，维持植株的机械组织(如纤维、厚壁组织)支撑力，而且作为屏障结构(如表皮)加强对细胞壁的保护，从而使植物体免受各种病原物的侵害。木质素与植物细胞壁中纤维素、半纤维素等相互交联形成复杂的网格结构，从而使植物的物理机械支撑能力变强；木质素疏水的特性所构成的植物细胞壁不易透水，这样有助于植物体维持自身的水分、矿物质和有机物的代谢稳定运输(Lee et al.,1997；李威,2018)。木质素是继纤维素之后植物次生细胞壁加厚形成的第二大天然有机化合物，主要沉积在维管束植物的次生细胞壁中，对植物细胞壁结构的完整性、加强植物机械支持和植物病原体防御中发挥重要作用(You和Mao,2013)。
[0006]木质素单体比例和单体间的键连接方式在不同植物物种中不尽相同，因此聚合形成的木质素化学结构高度可变而很难准确测定其结构。木质素是由多种芳香醇单体形成的一种复杂酚类聚合物，是苯丙烷类的衍生物，主要有芥子醇、香豆醇和松柏醇3种单体。这些
木质素单体最终经过脱氢聚合成结构复杂的木质素复合物。杨向东(2006)发现油菜木质素含量与抗菌核病之间存在显著正相关性。木质素单体之间的相对比例及不同类型之间的化学键决定着木质素的复杂性和特异性。
[0007]高等植物中会生成对
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羟基苯基木质素(p
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hydroxyphenyllignin，H
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木质素)、愈创木基木质素(guaiacyl lignin，G
‑
木质素)和紫丁香基木质素(syringyl lignin，S
‑
木质素)三种木质素单体。S型木质素由紫丁香基丙烷结构单体聚合而成，G型木质素由愈创木基丙烷结构单体聚合而成，H型木质素由对
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羟基苯基丙烷结构单体聚合而成。不同材料间木质素单体S/G/H有极显著差异。在病原体入侵等生物胁迫下，木质素单体比例会发生改变(Gayoso et al.,2010)。Eynck等(2012)以2个菌核病抗性不同的亚麻芥为材料，发现在抗病植株中木质素单体G/S高于感病植株。陈雪萍等(2017)发现在油菜中茎秆菌斑大小与木质素含量呈极显著相关，同时与单体G/S呈显著正相关。因此，木质素含量及其单体比例与作物抗病、抗逆有紧密的联系，可作为抗性的一个重要评价指标。
[0008]目前的研究表明苯丙氨酸解氨酶参与植物抗病反应，可能是木质素合成和单体组分调控机理研究的重要突破点。迄今为止，尚无通过病毒诱导的基因沉默(Virus
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Induced Gene Silencing,VIGS)技术编辑苯丙氨酸解氨酶基因来改良胡椒木质素及单体总量，提高胡椒抗病性的报道。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的在于提供一种能够提高胡椒抗瘟病的胡椒PNPAL3基因及其在胡椒抗瘟病中的应用。
[0010]为了达到上述目的，本专利技术的目的之一在于提供：胡椒PNPAL3基因，核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
[0011]本专利技术的目的之二在于提供：含有胡椒PNPAL3基因重组载体。
[0012]本专利技术的目的之三在于提供：胡椒PNPAL3基因编码的蛋白，氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
[0013]本专利技术的目的之四在于提供：胡椒PNPAL3基因或胡椒PNPAL3基因编码的蛋白在胡椒抗瘟病中的应用。
[0014]本专利技术的目的之五在于提供：一种提高胡椒抗瘟病方法，对PnPAL3基因进行烟草转化，得到木质素总含量升高、G型木质素含量升高、抗病性明显提高的转基因烟草植株。
[0015]优选地，对PnPAL3基因进行胡椒VIGS转化，利用农杆菌转化获得沉默胡椒PnPALs植株，沉默胡椒PnPALs植株叶片侵染病原菌后的叶片病斑明显增大。
[0016]本专利技术的原理和有益效果在于：
[0017]本专利技术首次发现一个在胡椒中特异调控木质素合成的苯丙氨酸解氨酶基因PnPAL3。对胡椒中PnPAL3进行烟草转化，得到木质素总含量升高、G型木质素含量升高的转基因烟草植株，且转基因烟草植株的抗病性明显提高，从而为植物抗病提供新思路。
[0018]对PnPAL3基因进行胡椒VIGS转化，利用农杆菌转化获得沉默胡椒PnPALs植株，沉默胡椒PnPALs植株叶片侵染病原菌后的叶片病斑明显增大，说明沉默胡椒PnPALs植株可能具有抵抗辣椒疫霉菌的作用，在胡椒抗瘟病反应中发挥重要作用。
[0019]本专利技术为植物的木质素遗传改良和定向分子育种奠定了基础，为植物基因工程提
供了新的基因资源，具有广泛的应用前景。
附图说明
[0020]图1为PnPAL3基因亚细胞定位结果图，其中Bright是明场，GFP是荧光蛋白，DAPI是细胞核染色，chlorophy本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.胡椒PNPAL3基因，其特征在于，核苷酸序列为SEQ ID NO:1。2.含有权利要求1所述胡椒PNPAL3基因的重组载体。3.根据权利要求1所述的胡椒PNPAL3基因编码的蛋白，其特征在于，氨基酸序列为SEQ ID NO:2。4.胡椒PNPAL3基因或胡椒PNPAL3基因编码的蛋白在胡椒抗瘟病中的应用。5.一种提高胡椒抗瘟病方...

【专利技术属性】
技术研发人员：范睿，苏岳峰，郝朝运，胡丽松，伍宝朵，吉训志，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院香料饮料研究所，
类型：发明
国别省市：