3-酮脂酰辅酶A硫解酶基因RKACAA1-2及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种3

【技术实现步骤摘要】
3
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酮脂酰辅酶A硫解酶基因RKACAA1
‑
2及其应用


[0001]本专利技术属于生物
和遗传工程领域，涉及一种3
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酮脂酰辅酶A硫解酶基因RKACAA1
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2及其应用。

技术介绍

[0002]类胡萝卜素（Carotenoid）是一类重要天然色素的总称，属萜类物质中的一类，具有多个共轭双键，颜色一般呈黄色、橙色或红色。类胡萝卜素的结构以类异戊二烯为基本单位，大多数典型的类胡萝卜素化学结构中含有40个碳原子，由8个类异戊二烯聚合而成。依据碳骨架末端化学基团的类型，可将类胡萝卜素划分为两大类别。一类为含有环状结构的闭环式类胡萝卜素，如α
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胡萝卜素、β
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胡萝卜素、叶黄素、花青素等。另一类为不含有环状结构的开环式类胡萝卜素，如八氢番茄红素、番茄红素等。目前，已在高等植物、动物、真菌等生物体中发现800多种天然类胡萝卜素，其中有约50种能够转化为维生素A，α
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胡萝卜素、β
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叶黄素和β
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胡萝卜素作为维生素A原对人体非常重要。
[0003]研究表明，类胡萝卜素是一类种类繁多、具有多种功能的脂溶性物质，其具有特殊营养价值，有转换为必需维生素的能力，它是一类能够给动植物提供天然色彩的重要天然色素，同时也是一种重要的抗氧化剂。典型的类胡萝卜素有β
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胡萝卜素、番茄红素、叶黄素等，其中β
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胡萝卜素具有抗氧化、抗癌、维生素A原、预防眼睛老年性黄斑病变、延缓衰老、提高免疫力等重要生理保健功能，番茄红素可以提高自身组织、细胞的抗氧化、增强免疫系统能力和效维持人体健康的作用，而叶黄素则是视网膜中黄斑色素的重要组成部分，可以过滤蓝光，防止视网膜受损等。类胡萝卜素种类繁多，不同的类胡萝卜素具有不同的生理功能，被广泛应用于医药、保健、食品、饲料的营养强化和着色等各个方面。
[0004]类胡萝卜素可通过生物（植物、微生物）提取法和化学合成法获取。其中化学合成色素的安全性备受质疑，一些化学合成类胡萝卜素（如虾青素）已被发现有害并且禁止药店销售。随着生物技术的发展和人们对食品安全的认识不断提高，生物提取法获得的天然来源的类胡萝卜素需求量越来越大。植物来源的天然类胡萝卜素生产成本相对较高，且受季节影响，而微生物来源的天然类胡萝卜素由于具有天然、高效、生产成本低、易实现工业化的优点而受到科研工作者的青睐。

技术实现思路

[0005] 本专利技术提供了一种3
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酮脂酰辅酶A硫解酶基因RKACAA1
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2，该基因是从红冬孢酵母（Rhodosporidium kratochvilovae）YM25235中分离得到；该基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或与SEQ ID NO:1互补的核苷酸序列，该基因序列长为1263bp（碱基），该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽。
[0006]本专利技术另一目的是将上述3
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酮脂酰辅酶A硫解酶基因RKACAA1
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2应用在促进微生物生产类胡萝卜素中。
[0007] 所述红冬孢酵母(Rhodosporidium kratochvilovae) YM25235具有生产周期短、
遗传稳定、生产安全等优点。
[0008]上述目的通过以下技术方案实现，从红冬孢酵母YM25235中提取总RNA，然后反转录合成cDNA，以合成cDNA为模板，通过PCR扩增获得目的片段，将载体pRH2034进行双酶切、回收，用一步克隆法将目的片段和载体连接，获得重组质粒pRHRKACAA1
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2，连接产物转入大肠杆菌中，通过PCR筛选出阳性单克隆，重组质粒pRHRKACAA1
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2用BamHⅠ、EcoR
Ⅴ
两个限制性内切酶进行酶切验证，验证阳性的克隆子培养后提取质粒，测序，获得片段大小为1263bp的3
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酮脂酰辅酶A硫解酶基因RKACAA1
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2；利用PEG介导的原生质体法将重组载体pRHRKACAA1
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2转化至红冬孢酵母YM25235中，筛选转化子，获得RKACAA1
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2的过表达菌株，过表达菌株经培养，利用紫外
‑
可见分光光度计测量总类胡萝卜素的含量。
[0009]本专利技术从红冬孢酵母（Rhodosporidium kratochvilovae）YM25235的总RNA基因中分离得到3
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酮脂酰辅酶A硫解酶基因RKACAA1
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2，该基因全长1263bp；将该基因转入到红冬孢酵母YM25235中，实验结果显示RKACAA1
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2基因的过表达会引起细胞内这个基因的转录水平在一定程度上的提高，说明外源基因在菌体内发生转录；RKACAA1
‑
2基因的过表达能够促进总类胡萝卜素的合成；本研究结果为揭示微生物提高类胡萝卜素产量机制提供了参考，将有助于通过基因工程手段对其进行改造来提高类胡萝卜素含量，对类胡萝卜素的工业化生产提供良好的应用前景和经济效益，为大规模商业化生产类胡萝卜素奠定基础。
附图说明
[0010]图1为本专利技术的红冬孢酵母YM25235的RKACAA1
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2基因PCR扩增图；1.DNA分子量标记DL2000；2.阴性对照；3.RKACAA1
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2的cDNA片段；图2为重组质粒pRHRKACAA1
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2的质粒图谱；图3为菌落PCR验证电泳图；1.DNA分子量标记DL2000；2.阴性对照；3. RKACAA1
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2的cDNA片段；4
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8为转化子；图4 重组质粒pRHRKACAA1
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2限制性酶切分析；1.DNA分子标量DL10000；2.阴性对照；3.空质粒pRH2034的BamHⅠ、EcoR
Ⅴ
双酶切；4.重组质粒pRHRKACAA1
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2的BamHⅠ、EcoR
Ⅴ
双酶切；5.RKACAA1
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2基因的cDNA片段；6. DNA分子标量DL2000；图5为重组质粒pRHRKACAA1
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2转化YM25235菌株阳性克隆验证；图中1. DNA分子标量DL2000；2.阴性对照；3.野生型菌株特异性基因条带；4.RKACAA1
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2的cDNA片段；5.转化子验证；图6为过表达菌株YM25235/pRHRKACAA1
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2与对照菌株YM25235的总类胡萝卜素含量比较。
具体实施方式
[0011]下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步详细说明，但本专利技术保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂，使用常规方法。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种3
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酮脂酰辅酶A硫解酶基因RKACAA1
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2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：张琦，杨晓霞，陈功水，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：