3-酮脂酰-CoA硫解酶基因RkACAA1-1及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种3

【技术实现步骤摘要】
3
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酮脂酰
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CoA硫解酶基因RkACAA1
‑
1及其应用


[0001]本专利技术属于生物和遗传工程
，涉及一种3
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酮脂酰
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CoA硫解酶基因RkACAA1
‑
1及其在促进微生物生产类胡萝卜素中的应用。

技术介绍

[0002]类胡萝卜素（Carotenoid）是一类重要的天然色素，是含有40个碳原子的异戊二烯聚合物。根据类胡萝卜素的分子组成，通常可以将其分为两类，一类是化学结构不含氧元素只含碳氢元素的胡萝卜素类（Carotenes），如α
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胡萝卜素、β
‑
胡萝卜素和番茄红素；一类是化学结构含有羟基、酮基、羧基、甲氧基等含氧官能团的叶黄素类（Xanthophylls），如玉米黄质、叶黄素和虾青素。目前，已在自然界中发现了超过800种的天然类胡萝卜素，其广泛的存在于高等植物、藻类、真菌和细菌中。
[0003]类胡萝卜素是动植物抗氧化系统中重要的组成，是保护机体免受氧化损伤的有效抗氧化剂。研究表明，人体不仅在正常的生命代谢活动中会生成活性氧，紫外线辐射、环境污染物等也会诱导活性氧的产生。人体内过量的氧自由基，会导致正常的生命大分子被氧化，从而对机体造成损伤。类胡萝卜素分子结构中存在类异戊二烯共轭双键，因此具有较强的抗氧化活性，能够保护细胞和组织免受活性氧破坏。除此之外，类胡萝卜素还是维生素A合成的前体物质，可以促进人类视觉系统的形成；其还具有抑制细胞异常生长，阻止低密度脂蛋白形成的功能，对维持机体健康、预防疾病、抗衰老和预防癌症方面有着重要作用。到目前为止，没有证据证明动物自身能够合成类胡萝卜素，只能依靠从外界摄入。
[0004]类胡萝卜素还有着丰富的颜色，随着分子中共轭双键数目、链长和取代基团的变化会呈现出不同的色彩。在食品药品行业，类胡萝卜素作为一种天然着色剂已经被广泛使用；而且得益于其抗氧化性，可以防止食品中的营养成分和风味物质遭到破坏，因此类胡萝卜素不仅可以提供诱人的色彩，还起到了延长食品保质期的作用。除了食品药品领域外，类胡萝卜素在养殖业中也有着重要的作用。向饲料中添加类胡萝卜素，不仅可以降低动物的发病风险、加强动物的免疫力，而且还能够改善肉类的品质，对于蛋类产品，则可以改善其蛋黄的色泽。
[0005]随着类萝卜素在医疗、食品、养殖等领域中越来越广泛的应用，需求量也日益增加。虽然已有许多研究者对如何提高类胡萝卜素的产量进行了相当多的研究，但现在类胡萝卜素的产量和质量仍不能满足市场需求。目前，主要的类胡萝卜素生产方法包括植物提取法、化学合成法和生物合成法。植物提取法成本过高，显然不适合商业化、大规模的生产；而化学合成法虽然在产量上可以满足需求，但是也存在环境不友好、化学物质残留、活性不比天然类胡萝卜素的缺点。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种从红冬孢酵母（Rhodosporidium kratochvilovae）YM25235中分离得到3
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酮脂酰
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CoA硫解酶基因RkACAA1
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1，该基因核苷酸
序列如SEQ ID NO:1所示或与SEQ ID NO:1互补的核苷酸序列，该基因序列长为1275bp（碱基），编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽。
[0007]本专利技术另一目的是将上述3
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酮脂酰
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CoA硫解酶基因RkACAA1
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1应用在生产类胡萝卜素中。
[0008]上述目的通过以下技术方案实现，从红冬孢酵母YM25235中提取总RNA，然后反转录合成cDNA，以合成cDNA为模板，通过PCR扩增获得目的片段，载体pRH2034进行双酶切、回收，用一步克隆法将目的片段和载体连接，获得重组质粒pRHRkACAA1
‑
1，连接产物转入大肠杆菌中，通过PCR筛选出阳性单克隆，重组质粒pRHRkACAA1
‑
1用BamHⅠ、EcoR
Ⅴ
两个限制性内切酶进行酶切验证，验证阳性的克隆子培养后提取质粒，测序，获得片段大小为1275bp的3
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酮脂酰
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CoA硫解酶基因RkACAA1
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1；利用PEG介导的原生质体法将重组载体pRHRkACAA1
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1转化至红冬孢酵母YM25235中，筛选转化子，获得RkACAA1
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1过表达菌株，过表达菌株经培养，利用紫外
‑
可见分光光度计测量菌株中总类胡萝卜素的含量。
[0009]本专利技术从红冬孢酵母（Rhodosporidium kratochvilovae）YM25235的总RNA中分离得到3
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酮脂酰
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CoA硫解酶基因RkACAA1
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1，红冬孢酵母YM25235中RkACAA1
‑
1基因的过表达会引起细胞内这个基因的转录水平在一定程度上有一定的提高，说明外源基因在菌体内发生转录，继而翻译成相应蛋白，引起细胞内与类胡萝卜素合成相关的酶的表达量的提高，本研究结果有助于阐明红冬孢酵母YM25235中产类胡萝卜素机制，为揭示微生物提高类胡萝卜素产量机制提供参考，将有助于通过基因工程手段对其进行改造来提高类胡萝卜素含量，对类胡萝卜素的工业化生产提供良好的应用前景和经济效益，为大规模商业化生产类胡萝卜素奠定基础。
附图说明
[0010]图1为本专利技术的红冬孢酵母YM25235的RkACAA1
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1基因PCR扩增图；1.DNA分子量标记DL2000；2.阴性对照；3.RkACAA1
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1的cDNA片段；图2为重组质粒pRHRkACAA1
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1质粒图谱；图3为菌落PCR验证电泳图；1.DNA分子量标记DL2000；2.阴性对照3. RkACAA1
‑
1的cDNA片段；4
‑
8为转化子；图4为重组质粒pRHRkACAA1
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1限制性酶切分析；其中：1.DNA 分子量标记DL10000 2.阴性对照；3.空质粒pRH2034的BamHⅠ、EcoR
Ⅴ
双酶切；4.重组质粒pRHRkACAA1
‑
1的BamHⅠ、EcoR
Ⅴ
双酶切；5.RkACAA1
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1的cDNA片段；6.DNA 分子量标记DL2000；图5重组质粒pRHRkACAA1
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1转化红冬孢酵母YM25235阳性克隆验证；1.DNA分子量标记DL2000；2.阴性对照3.野生型菌株特异性基因条带；4.RkACAA1
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1cDNA片段；5.转化子验证；图6过表达菌株YM25235/pRHRkACAA1
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1与对照菌株YM25235本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种3
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酮脂酰
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CoA硫解酶基因RkACAA1
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1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：张琦，陈功水，魏云林，季秀玲，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：