灰树花葡聚糖基转移酶gfgel4及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术公开了灰树花葡聚糖基转移酶gfgel4及其编码基因和应用，本发明专利技术属于食用菌遗传和基因工程技术领域，具体涉及灰树花葡聚糖基转移酶gfgel4及其编码基因和应用；本发明专利技术首次从灰树花菌丝体基因组中克隆得到葡聚糖合成过程中分支结构的形成的关键酶—β

【技术实现步骤摘要】
灰树花葡聚糖基转移酶gfgel4及其编码基因和应用


[0001]本专利技术属于食用菌遗传和基因工程
，具体涉及葡聚糖基转移酶gfgel4其编码基因和应用。

技术介绍

[0002]食药用真菌多糖是当前国内外研究十分活跃的领域之一，其广泛参与细胞中各种生命代谢活动，具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、免疫调节等多种生物学活性，其中，葡聚糖是由D
‑
葡萄糖之间通过β
‑
1,3和/或β
‑
1,6糖苷键链接聚合而成的多糖，具有多种生物活性，而分支度适中的多糖往往具有较高的生物活性，例如分支度在0.31－0.36的灰树花葡聚糖具有较强的免疫活性。
[0003]然而，食药用真菌多糖的合成过程极为复杂，参与合成的底物和酶系众多，且可参考的技术方法严重不足，因而对其了解和认识十分有限。研究发现，葡萄糖作为灵芝发酵的碳源时，除供菌体自身生长需求外，还会被多种核苷酸糖合成酶(如UDP
‑
葡萄糖焦磷酸化酶、UDP
‑
葡萄糖
‑4‑
差向异构酶、GDP
‑
甘露糖焦磷酸化酶和dTDP
‑
葡萄糖焦磷酸化酶等)转化为相应的UDP
‑
葡萄糖、UDP
‑
半乳糖、GDP
‑
甘露糖和dTDP
‑
鼠李糖等核苷酸糖，并推测糖基转移酶可能与多糖支链的形成有着密切的关系，因此，要实现食药用真菌葡聚糖高效而稳定的合成，还需明确葡聚糖合成相关酶系的功能，并采取具有针对性的代谢调控手段以有效强化其合成。
[0004]灰树花(Grifola frondosa)是富含多糖和蛋白质等营养成分的食用菌。已有的研究结果显示，灰树花子实体中纯化出的葡聚糖(D
‑
fraction)具有显著的抗肿瘤和免疫调节等活性。已有研究证实，灰树花菌丝体多糖或胞外多糖中的单糖组成和含量与核苷酸糖合成酶的活性直接相关，灰树花胞外葡聚糖的分支度与糖基转移酶也有着密切关系。但多数食用真菌葡聚糖含有不同比例的分支结构，那么这些分支结构如何形成，哪些酶涉及葡聚糖分支化重构，目前还未得到系统研究。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的是提供对灰树花胞外葡聚糖一级结构进行简单修饰和有效改变灰树花多糖合成量的技术手段。具体的，本专利技术的目的在于提供灰树花多糖合成相关酶，即β
‑
1,3葡聚糖基转移酶，同时提供灰树花β
‑
1,3葡聚糖基转移酶编码基因序列、基因沉默和基因过表达质粒、基因工程菌及生产方法。
[0006]为实现灰树花菌丝体多糖高效而稳定的合成和进一步提升灰树花发酵产品品质的目标，本专利技术首次从灰树花菌丝体基因组中克隆得到多糖合成关键酶－β
‑
1,3
‑
葡聚糖基转移酶的编码基因，并通过基因沉默证明该基因在灰树花菌丝体生长和多糖合成过程中的关键角色；
[0007]最后通过基因工程技术，在灰树花中过表达β
‑
1,3
‑
葡聚糖基转移酶，显著提高了重组菌株的多糖合成产量以及提高了胞外多糖的分支度。本专利技术将有助于从分子水平理解
食药用真菌多糖的合成机制，开展食药用真菌多糖合成的代谢工程研究和高效发酵生产品质稳定的多糖提供重要的技术支持和参考。
[0008]本专利技术通过RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术进行灰树花β
‑
1,3
‑
葡聚糖基转移酶基因沉默，以及通过同源重组技术进行灰树花β
‑
1,3
‑
葡聚糖基转移酶基因过表达，为分子水平理解食药用真菌多糖的合成机制和高效生产免疫增强剂多糖提供行之有效的解决策略和方法，所构建的重组菌株能以葡萄糖、淀粉水解物和木质纤维素等底物合成多糖。
[0009]本专利技术提供灰树花β
‑
1,3
‑
葡聚糖基转移酶(1,3
‑
beta
‑
glucanosyltransferase
‑
gfgel4)，编码所述gfgel4基因序列全长1945bp，如SEQ ID NO.1所示；所述酶包括1个完整的开放阅读框，共编码554个氨基酸，如SEQ ID NO.2所示。
[0010]本专利技术还提供所述灰树花β
‑
1,3
‑
葡聚糖基转移酶在改变多糖合成量中的用途，所述改变包括上调或下调灰树花多糖合成量；进一步的，所述上调多糖合成量是通过表达编码灰树花β
‑
1,3
‑
葡聚糖基转移酶基因实现；所述下调多糖合成量是通过基因沉默编码灰树花β
‑
1,3
‑
葡聚糖基转移酶基因实现；进一步的，所述上调灰树花多糖合成量是通过表达灰树花β
‑
1,3
‑
葡聚糖基转移酶基因的全序列(SEQ ID NO.1)实现，所述下调灰树花多糖合成量是通过基因沉默灰树花β
‑
1,3
‑
葡聚糖基转移酶基因的保守序列(SEQ ID NO.3)实现。
[0011]本专利技术还提供所述灰树花β
‑
1,3
‑
葡聚糖基转移酶在改变胞外葡聚糖分支度中的用途，所述改变包括增大或减小灰树花胞外葡聚糖的分支度；进一步的，所述增大或者减小胞外葡聚糖分支度是通过表达或者基因沉默编码灰树花β
‑
1,3
‑
葡聚糖基转移酶基因实现。
[0012]本专利技术还提供两种重组载体，即过表达载体，所述载体包含所述灰树花β
‑
1,3
‑
葡聚糖基转移酶基因gDNA序列(SEQ ID NO.1)，用于增加灰树花胞外葡聚糖的分支度以及上调灰树花多糖合成量。所述重组载体是通过扩增β
‑
1,3
‑
葡聚糖基转移酶基因gDNA序列(SEQ ID NO.1)，经同源重组连接酶分别与质粒pAN7
‑
gpd和pAN7
‑
35s连接获得；根据本专利技术的实施例之一，所述的基因过表达载体为pAN7
‑
gpd
‑
gfgel4和pAN7
‑
35s
‑
gfgel4。
[0013]所述重组载体还包括灰树花gpd启动子(SEQ ID NO.4)和构巢曲霉35s启动子(SEQ ID NO.5)，即基因沉默载体。质粒pAN7
‑
1(购于湖南丰晖生物科技有限公司)经HindⅢ单酶切，将酶切产物与上述获得的35s启动子(SEQ ID NO.5)目的片段通过同源重组连接酶连接得到pAN7
‑
35s质粒；pAN7
‑
35s质粒经SbfⅠ和BamHⅠ双酶切，将酶切产物与上述获得的gpd启动子(S本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.灰树花β
‑
1,3
‑
葡聚糖基转移酶的编码基因，其包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。2.灰树花β
‑
1,3
‑
葡聚糖基转移酶的编码基因，其包括SEQ ID NO.3所示的灰树花葡聚糖合成酶基因保守序列。3.权利要求1
‑
2中任一项所述编码基因编码的蛋白。4.根据权利要求1所述的SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的重组表达载体。5.根据权利要求2所述的SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的重组表达载体。6.根据权利要求5所述的重组表达载体，所述载体还包括灰树花gpd启动子序列和构巢曲霉35s启动子序列，所述灰树花gpd启动子序列如SEQ ID NO.4所示，所述构巢曲霉35s启动子序列如SEQ ID NO.5所示。7...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔凤杰，朱业君，汝成业，顾韬，朱鸿安，
申请(专利权)人：江苏康铂特医食品有限公司，
类型：发明
国别省市：