一种微拟球藻遗传转化体系及合成甘油三酯的基因和应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域。本发明专利技术涉及一种合成甘油三酯(TAG)的基因、高效、稳定的遗传转化体系及其在提高甘油三酯含量中的应用。合成甘油三酯(TAG)的基因具有SEQ ID NO 1所示的碱基序列；或，2)与序列表中序列1所限定的核酸序列具有95％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的DNA序列。以及通用表达载体为：1)具有SEQ ID NO 2所示的碱基序列；或，2)与序列表中序列2所限定的核酸序列具有90％以上同源性、且具有相同功能的DNA序列。并给出优化转化方法，使得本发明专利技术所建立的遗传转化体系，对于利用基因工程进行工业微藻性状改良，具有巨大的应用前景。的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种微拟球藻遗传转化体系及合成甘油三酯的基因和应用


[0001]本专利技术属于生物
本专利技术涉及一种合成甘油三酯(TAG)的基因、高效、稳定的遗传转化体系及其在提高甘油三酯含量中的应用。

技术介绍

[0002]真核微藻由于具有生长速度快、光合效率高、环境适应性强等特点，而被视作生产糖类、脂类及生物活性物质的“细胞工厂”(Hu et al.,2008)。此外，部分真核微藻如小球藻、微拟球藻可在户外大规模培养，具有极大的工业化潜力(Wijffels et al.,2010)。近年来，蓬勃发展的以各种组学数据为基础的系统生物学，开创了微藻合成生物学的崭新时代。在微藻合成生物学领域，要对某个特定藻种(株)进行设计改造，很大程度上取决于该藻种(株)的遗传转化体系是否建立。目前已有30余个微藻物种实现了基因导入与表达，尤其是在真核微藻的模式物种—莱茵衣藻中，已在细胞核、叶绿体和线粒体三套基因组中均建立了遗传转化体系(Kindle et al.,1990；Randolphanderson et al.,1993；Boudreau et al.,1997)。然而，在微藻遗传转化体系的建立过程中，有两大瓶颈亟待突破：一是目前建立的遗传转化体系存在不稳定的隐患，以莱茵衣藻为例，其核转化藻株常会在传代过程中发生质粒丢失(Kindle et al.,1990)；二是在工业微藻中，高效、稳定的遗传转化体系尚未建立，以小球藻为例，虽然异养培养技术早已成熟，但遗传转化体系的缺乏，极大地限制了小球藻的工业化进程(Liu et al.,2019)。
[0003]目前，微拟球藻已经崛起为具有工业开发潜力的模式微藻，美国Solix公司、Aurora公司和以色列Seambiotic公司都已将微拟球藻用于大规模户外养殖；由于微拟球藻基因组小(约30Mb)，基因结构紧凑，冗余序列极少，因而适宜作为底盘生物创建新型光合细胞工厂(Poliner et al.,2018)；目前，针对微拟球藻已经开发出多种遗传操作工具，例如同源重组(Kilian et al.,2011；Nobusawa et al.,2017)、过表达(Xin et al.,2017)、RNA干扰(Xin et al.,2017)以及基于CRISPR/Cas9的基因编辑(Wang et al.,2016)，这些遗传工具将有力推动微拟球藻合成生物学的发展。然而，目前微拟球藻已报道的最高转化效率仅为2500cfu/μg DNA(Kilian et al.,2011)，虽可勉强满足靶基因的定向改造，但却不足以完成各种突变体库与合成生物学工程株系的高通量构建与筛选。因此，急需建立一套高效、稳定的微拟球藻遗传转化体系，以促进工业微藻合成生物学的快速发展。
[0004]甘油三酯(triacylglycerol,TAG)是生物柴油的主要原料，微拟球藻能够在胁迫条件下大量积累TAG，且与陆生油料作物相比，许多微拟球藻株系由于具备抗逆性强、对环境需求低等特点，而被视为潜力巨大的生物柴油来源(Bondioli et al.,2012)。在高等植物和微藻中，现有证据表明TAG合成的最后一步反应是该通路中的限速步骤，由二酰甘油酰基转移酶(diacylglycerol acyltransferase,简称DGAT)负责完成(Chen et al.,2012)。在高等油料作物中，已有很多通过增加内源DGAT表达量来提高TAG含量的案例(Roesler et al.,2016)。综上所述，利用微拟球藻遗传转化体系改造其DGAT，进而提高细胞TAG含量，具有明显的必要性和可行性，但并未有相关报道证明其是否能够实现。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种微拟球藻中合成甘油三酯(TAG)的基因、高效、稳定的遗传转化体系及其在提高甘油三酯含量中的应用。
[0006]为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0007]一种合成甘油三酯(TAG)的基因：
[0008]1)具有SEQ ID NO 1所示的碱基序列；
[0009]或，
[0010]2)与序列表中序列1所限定的核酸序列具有95％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的DNA序列。
[0011]一种基因所编码的蛋白，所述基因所编码的蛋白为具有下列情况之一的氨基酸序列：
[0012]1)具有SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列；
[0013]2)通过将SEQ ID NO 3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而产生的衍生蛋白质的氨基酸序列，该衍生蛋白质与SEQ ID NO 3的蛋白具有相同的生物学功能。
[0014]一种构建所述基因的方法，包括如下步骤：
[0015]1)从微拟球藻的cDNA中扩增DGAT基因；
[0016]2)回收扩增产物连接到测序载体上，通过测序获得微拟球藻DGAT基因的全长编码序列，即SEQ ID NO1所示的碱基序列。
[0017]一种所述基因的应用，所述合成甘油三酯(TAG)的基因在调控生物体内TAG含量中的应用。
[0018]一种构建所述的具有甘油三酯(TAG)合成功能的基因的引物：引物为1)和2)：
[0019]1)NoDGAT2B-for：
[0020]5’
GGTACCACATAATGACGCAGGTC 3
’
；
[0021]2)NoDGAT2B-rev：
[0022]5’
GAATTCTCACTTAATAAGCAGCTTCTTG 3
’
。
[0023]一种通用的微拟球藻遗传转化表达载体：
[0024]1)含SEQ ID NO2所示的碱基序列；
[0025]或，
[0026]2)含与序列表中序列2所限定的核酸序列具有90％以上同源性、且具有相同功能的DNA序列。
[0027]所述优选通用的微拟球藻遗传转化表达载体为载体pXJ450。
[0028]一种通用的微拟球藻遗传转化表达载体的应用，所述表达载体在改造微拟球藻基因组序列及遗传表型中的应用。
[0029]具体为：将对数生长期的微拟球藻藻液、通用表达载体和鲑鱼精DNA混匀于f/2液体培养基，然后于25℃，100rpm条件下避光复苏48h；复苏后离心收集藻体沉淀，将其与玉米淀粉悬液混匀，混匀后于含zeocin和NaHCO3的f/2琼脂糖平板上，25℃避光培养3天后，再以25℃，80μmol m-2
s-1
光照培养直至克隆长出，使微拟球藻高效、稳定的转化。
[0030]一种重组载体，重组载体含SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所述的DNA序列。
[0031]进一步的说，优选重组载体为pXJ419。
[0032]一种宿主细胞，宿主细胞含所述重组载体。所述宿主细胞为微拟球藻。
[0033]一种重组载体高效、稳定的转化方法：
[0034]将对数生长期的微拟球藻藻液本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种合成甘油三酯(TAG)的基因，其特征在于：1)具有SEQ ID NO 1所示的碱基序列；或，2)与序列表中序列1所限定的核酸序列具有95％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的DNA序列。2.一种权利要求1所述基因所编码的蛋白，其特征在于：所述基因所编码的蛋白为具有下列情况之一的氨基酸序列：1)具有SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列；2)通过将SEQ ID NO 3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而产生的衍生蛋白质的氨基酸序列，该衍生蛋白质与SEQ ID NO 3的蛋白具有相同的生物学功能。3.一种构建权利要求1所述基因的方法，其特征在于：包括如下步骤：1)从微拟球藻的cDNA中扩增DGAT基因；2)回收扩增产物连接到测序载体上，通过测序获得微拟球藻DGAT基因的全长编码序列，即SEQ ID NO1所示的碱基序列。4.一种权利要求1所述基因的应用，其特征在于：所述合成甘油三酯(TAG)的基因在调控生物体内TAG含量中的应用。5.一种构建权利要求1所述的具有甘油三酯(TAG)合成功能的基因的引物，其特征在于：引物为1)和2)：1)NoDGAT2B-for：5
’
GGTACCACATAATGACGCAGGTC 3
’
；2)NoDGAT2B-rev：5
’
GAATTCTCACTTAATAAGCAGCTTCTTG 3
’

【专利技术属性】
技术研发人员：辛一，王勤涛，徐健，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：