本发明专利技术公开了一种新型冠状病毒受体结合区(Receptor Bind Domain，RBD)糖基化改造抗原，所述糖基化改造抗原是将新冠病毒受体结合区RBD进行N糖基化位点截短并串联形成单链多聚体形式，减少RBD表面天然糖基遮蔽以更好地暴露抗原表位。该抗原相较于野生型RBD单体与RBD多聚体形式，能够激发机体产生更高水平的新冠病毒特异性抗体与中和抗体；一针免疫即可达到与野生型RBD单体两针免疫同等的免疫效果；免疫血清针对原始毒株与变异毒株具有相近的中和效价，呈现了良好的交叉保护作用。本发明专利技术还提供了所述糖基化改造抗原在制备新型冠状病毒治疗、预防药物或者疫苗中的应用。预防药物或者疫苗中的应用。预防药物或者疫苗中的应用。
【技术实现步骤摘要】
一种新型冠状病毒受体结合区糖基化改造抗原及应用
[0001]本专利技术涉及一种新型冠状病毒受体结合区糖基化改造抗原和应用，属于多肽
技术介绍
[0002]迄今为止，新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2)已造成约1.8亿人感染和近400万人死亡，给人类健康带来极大威胁(https://covid19.who.int/)。SARS
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CoV
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2主要通过呼吸道和密切接触传播，目前尚无特效治疗药物，疫苗是预防和控制疫情的最有效手段。在全球范围内先后开展了上百项SARS
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CoV
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2疫苗研究，其中mRNA疫苗、腺病毒载体疫苗、灭活疫苗、重组亚单位疫苗等多种疫苗类型已取得重要进展。部分疫苗已获批上市，为应对新冠病毒疫情提供了强大科技支撑。随着疫情的不断蔓延，新冠病毒毒株一直处于不断变异中，目前已经出现多种被世界卫生组织(WHO)标记为“需要关注”的新冠病毒变异毒株，包括Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma(P.1)和Delta(B.1.617.2)等(https://www.who.int)。与原始毒株相比，已有疫苗免疫后血清针对以Beta(B.1.351)为代表的部分变异毒株的中和活性显著降低(Cell Res 31:732
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741(2021))。因此，研制一种更为高效、广谱的新冠疫苗以更好地应对变异毒株显得尤为重要。
[0003]新冠病毒刺突糖蛋白S位于膜结构的最外层，在介导病毒与宿主受体结合以及病毒进入细胞的过程中扮演重要角色。其受体结合区(Receptor Bind Domain，RBD)位于S蛋白的N端S1域，可通过受体结合序列(Receptor Binding Motif，RBM)与细胞表面的ACE2特异结合。RBD不仅是病毒与宿主受体结合和进入宿主细胞的靶标位点，同样也是主要的中和表位区域，成为重组亚单位疫苗开发的重要目标。国内外多家单位以RBD为主要抗原的疫苗已经推向临床，结果显示RBD能够激发特异性的抗体与中和抗体反应，但是仍然存在免疫原性较低、交叉保护不足等缺点，需要对其进行改造与优化以提升其免疫效力(Nature 586:572
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577(2020)；Cell 182:722
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733(2020))。糖基化是蛋白的一种常见翻译后修饰形式，糖基化的改变会对蛋白质的结构和功能产生显著影响。以往研究表明，在存在过度糖基化修饰的酵母表达系统中，糖基化改造对SARS的RBD抗原免疫原性具有重要影响(Vaccin.Immunother.10:648
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658(2014))。
[0004]本专利技术的目的在于提供一种新型冠状病毒受体结合区RBD糖基化改造抗原，减少RBD表面天然糖基遮蔽并更好的暴露抗原表位，以使所述抗原能够激发更高水平的针对新型冠状病毒的特异性抗体与中和抗体，一针免疫即可达到较好的免疫效果，同时可提供针对新冠病毒变异毒株的强烈交叉保护。
技术实现思路
[0005]基于上述目的，本专利技术首先提供了一种新型冠状病毒受体结合区(Receptor Bind Domain，RBD)糖基化改造抗原。糖基化是蛋白的一种常见翻译后修饰形式，糖基化的改变会对蛋白质的结构和功能产生显著影响。根据已报道的新冠病毒RBD蛋白的两个重要N糖基化
位点(分别位于第331和343位氨基酸处)(Science 369:330
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333(2020))，对RBD进行N
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糖基化改造，减少RBD表面天然糖基遮蔽并更好地暴露抗原表位以提升其免疫原性，改造方式为截短全长RBD
219(R319
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K537)
区域的N
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糖基位点或者对其进行点突变。
[0006]在本专利技术的抗原N
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糖基化改造技术方案中，所述糖基化改造抗原是去除新冠病毒受体结合区RBD 1或2个糖基化位点的截短型抗原。
[0007]在一个优选的实施方案中，所述糖基化改造抗原是将新冠病毒受体结合区RBD
219
进行N1糖基化位点截短(截短去掉319位精氨酸R至331位天门冬酰胺N共13个氨基酸)而成的截短型抗原，所述截短型抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0008]其次，本专利技术还提供了一种新型冠状病毒受体结合区糖基化改造抗原，所述糖基化改造抗原为由上述的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的新型冠状病毒受体结合区糖基化改造抗原串联而成的多聚体。
[0009]在一个优选的实施方案中，所述多聚体可以为串联形成的单链二聚体形式，也可以为三聚体或以上的多聚体。本领域技术人员可以知晓，只要不影响去糖基遮蔽并暴露了抗原表位，应用以上单体糖基化改造抗原构建3个以上的多聚体，也都能够符合本专利技术的专利技术构思，达到本专利技术所需求的技术效果。
[0010]本专利技术提供的单体抗原RBD
206
及其多聚体相较于野生型RBD
219
单体与多聚体形式，去除了糖基遮蔽并暴露了抗原表位，能够激发更高水平的针对新冠病毒的特异性抗体与中和抗体。联合高效佐剂后，一针免疫即可达到较好的免疫效果；同时可提供针对新冠变异毒株的强烈交叉保护。
[0011]设计并通过Expi293F哺乳动物细胞表达系统成功制备了3种糖基化改造抗原(RBD
219
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N331A、RBD
219
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N343Q、RBD
206(I332
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K537)
)。将糖基化改造RBD蛋白通过与铝佐剂联用免疫小鼠并进行血清抗体检测，实验结果表明截短去除N1糖基化位点的糖基化改造抗原RBD
206
与野生型RBD
219
抗原相比能够显著提升所激发的抗体水平(p<0.001)。随后，通过结构优化设计，将RBD
206
糖基化改造抗原进行串联重复以形成单链多聚体形式进一步提升其免疫原性。初步免疫评价结果显示，二聚体RBD
206
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dimer、三聚体RBD
206
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trimer与单体RBD
206
相比抗体水平显著提升(P<0.01)，且二聚体与三聚体无显著性差异。因此，后续评价以RBD
206
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dimer为代表抗原详细展开。
[0012]通过与铝佐剂联用免疫小鼠进行免疫评价，试验结果表明RBD
206
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dimer两次免疫后抗体滴度达到约106，约为野生型RBD
219
抗原激发抗体滴度的近百倍(p<0.001)，也显著优于糖基改造单体RBD
206
(p<0.001)以及野生型二本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种新型冠状病毒受体结合区糖基化改造抗原，其特征在于，所述糖基化改造抗原是去除新冠病毒受体结合区RBD 1或2个糖基化位点的截短型抗原。2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒受体结合区糖基化改造抗原，其特征在于，所述糖基化改造抗原是去除新冠病毒受体结合区RBD第1个N糖基化位点N331的截短型抗原，所述截短型抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。3.一种新型冠状病毒受体结合区糖基化改造抗原，其特征在于，所述糖基化改造抗原为由权利要求2所述新型冠状病毒受体结合区糖基化改造抗原串联而成的多聚体。4.根据权利要求3所述的新型冠状病毒受体结合区糖基化改造抗原，其特征在于，所述多聚体为二聚体或者三聚体。5.权利要求1
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4任一所述新型冠状病毒RBD糖基化改造抗原在制备新型冠状病毒治疗、预防药物或者疫苗中的应用。6.根据权利要求5所述应用所制备的疫苗，其特征在于，所述疫苗还包括铝佐剂和/或CpG佐剂。7.一种编码权利要求2中所述RBD糖基化改造抗原的多核苷酸分子。8.根据权利要求7所述的多核苷酸分子，其特征在于，所述多核...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈薇，宰晓东，徐俊杰，周楚格，于蕊，张军，殷瑛，张跃，李汭桦，李耀辉，赵晓帆，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：
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