蛋白酶可切割的双特异性抗体及其用途制造技术

本发明专利技术提供了重组双特异性抗体，其设计成结合靶细胞上的表面抗原和免疫细胞如T细胞上的活化组分。双特异性抗体包含两条多肽链，其含有Fv和Fab作为抗原结合片段以及经修饰的Fc区，以促进异源二聚体形成。在一个实施方案中，双特异性抗体进一步包含蛋白酶切割位点和/或基序，其将引起抗原结合位点的空间闭塞，使得抗体仅在特定的环境中，例如在肿瘤附近才得以激活。在另一个实施方案中，双特异性抗体包含经修饰的序列，其赋予对CD3的结合亲和力降低和/或来自不同物种的细胞的CD3的交叉反应性结合。结合。结合。

【技术实现步骤摘要】
蛋白酶可切割的双特异性抗体及其用途
[0001]本申请是基于申请日为2019年12月20日，优先权日为2018年12月21日，申请号为201980082578.7，专利技术名称为：“蛋白酶可切割的双特异性抗体及其用途”的专利申请的分案申请。
[0002]相关申请的交叉引用
[0003]该国际申请要求享有2018年12月21日提交的美国临时专利申请第62/783,411号和2019年3月7日提交的美国临时专利申请第62/815,132号的优先权。

技术介绍

[0004]抗体是丙种球蛋白，主要称为免疫球蛋白(Ig)。单体抗体由两条重链和两条轻链组成。多肽链的氨基端末端在氨基酸组成上显示出相当大的变化，并被称为可变(V)结构域/区域，以将它们与相对恒定的(C)结构域/区域区分开。每条轻链具有可变结构域和恒定结构域。每条重链具有四个结构域：可变结构域和恒定结构域1、2和3。抗原结合位点位于Fab(抗原结合片段)区中，该区域包括轻链可变结构域(VL)，重链可变结构域(VH)，轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域1(CH1)。轻链可变结构域(VL)和重链可变结构域(VH)的组合称为Fv(可变片段)区。抗体的Fc(可结晶片段)区包括重链恒定结构域2和3(CH2和CH3)。
[0005]每个可变结构域含有三个高变环，称为互补决定区(CDR)，均匀分布在四个可变程度较低的框架(FR)区之间。正是CDR提供了抗体表面上的特异性抗原识别位点，并且这些区域的高度可变性使抗体能够识别几乎无限数量的抗原。重链和轻链通过非共价相互作用和共价链间二硫键的组合而保持在一起，从而形成两侧对称的结构。铰链区是第一和第二恒定结构域(CH1和CH2)之间的重链区域，并通过二硫键保持在一起。该柔性铰链区允许两个抗原结合位点之间的距离发生变化。
[0006]在各种临床环境如癌症疗法中，经常期望选择性破坏单个靶细胞或特定靶细胞类型。实现此目的的一种方法是通过诱导针对肿瘤的免疫应答，例如通过使免疫效应细胞如自然杀伤(NK)细胞或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)攻击并破坏肿瘤细胞。在这方面，近年来，设计成结合靶细胞上表面抗原和T细胞受体(TCR)复合物的激活不变组分的双特异性抗体已成为人们关注的问题。此类抗体与其两个靶标的同时结合将迫使靶细胞和T细胞之间的暂时相互作用，从而引起细胞毒性T细胞的活化和随后靶细胞的裂解。因此，免疫应答重新定向至靶细胞，并且与正常MHC限制的CTL活化一样，不依赖于靶细胞的肽抗原呈递或T细胞的特异性。
[0007]随着基因和蛋白质工程技术的最新发展，双特异性抗体(BsAb)如BiTE已经出现，显示出有希望的应用。BiTE(双特异性T细胞衔接器)是一种融合蛋白类型，其具有两个单链抗体可变片段(scFv)，其中一个靶向CD3，另一个靶向肿瘤抗原，并通过(G4S)3多肽接头接合。在不存在Fc的情况下，这些抗体不能用蛋白A和G纯化，并且体内半衰期短。因此，在临床使用中需要连续输注。而且，单链形式的双特异性抗体(scFv)及其变体具有容易聚集的问题。
[0008]还存在其他双特异性抗体技术。Roche CrossMab含有Fc，并因此具有比BiTE长得
多的体内半衰期。CrossMab使用突起
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进入
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凹洞(knob
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in
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hole)技术进行Fc异源二聚化，但其无法产生100％异源二聚体抗体。在CrossMab中，使用野生型IgG1 Fc和铰链，其使CrossMab能够结合所有表达Fc受体(FcR)的细胞，如巨噬细胞。结果，T细胞将不仅杀伤癌细胞，而且会杀伤表达FcR的细胞，从而导致称为淋巴细胞减少症的副作用。
[0009]来自Xencor Inc.和Synimmune GMBH的双特异性抗体包含分别与Fc多肽的N端和C端连接的两个抗原结合结构域。N端和C端处两个结合位点之间的长距离不利于诱导免疫突触，如在自然细胞毒性T细胞识别过程中形成的突触。
[0010]Amgen开发的蛋白酶可激活的双特异性蛋白质(美国专利申请公开号2017/0247476)使用两个scFv作为抗原结合片段，CD3ε结构域以掩蔽CD3结合，CH1
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CL用于异源二聚化，以及野生型IgG Fc或具有异源二聚体变化(如突起
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进入
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凹洞突变)的Fc以延长半衰期。但是，使用scFv可能导致蛋白质的聚集和不稳定。尽管CH1
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CL已用作异源二聚化支架来生成双特异性抗体或多价融合蛋白，但需要VH
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VL和CH1
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CL界面之间的协同以实现相互稳定。据报道，在不存在VH
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VL的情况下，CH1
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CL不足以产生异源二聚体产物。此外，具有当前已知的异源二聚化改变的Fc不能完全形成异源二聚体。
[0011]由Roche开发的蛋白酶激活的T细胞双特异性分子(国际申请公开号WO2017/162587)基于上述CrossMab平台，并使用独特型特异性scFv作为掩蔽部分来阻断CD3抗体的结合。该设计继承了与上述CrossMab平台和scFv片段相关的缺点。
[0012]国际申请号PCT/US18/43232公开了靶向FLT3和CD3两者的双特异性抗体，其中双特异性抗体包括与抗FLT3抗体的Fab融合的抗CD3抗体的单链可变片段(scFv)。但是，对于CD3和FLT3的结合结构域未被掩蔽，且未掺入蛋白酶敏感的多肽接头。
[0013]具有改善的药代动力学性质的双特异性抗体将是理想的，以消除对连续给药的需要。但是，较长的半衰期可能导致T细胞活化时间延长或定位不良，从而导致不良副作用。因此，本领域需要如下双特异性抗体形式，其具有相当长的半衰期，但是在疾病微环境中例如在肿瘤附近被特异性激活。
[0014]专利技术概述
[0015]本专利技术提供了重组双特异性抗体，其设计成结合靶细胞上的表面抗原和免疫细胞如T细胞上的激活组分。在一个实施方案中，本专利技术的双特异性抗体包含作为抗原结合片段的Fv和Fab和经修饰的Fc区，其导致包括100％异源二聚体的最终产物的优异性能，高产率，高稳定性，低聚集倾向和延长的半衰期。在另一个实施方案中，本专利技术的双特异性抗体还可以包含蛋白酶切割位点和/或基序，其将引起抗原结合位点的空间闭塞，使得抗体仅在特定的环境中(例如，在肿瘤附近)被激活。
[0016]在一个实施方案中，本专利技术提供了重组双特异性抗体，其包含
[0017](i)第一多肽，其从N至C端包含第一轻链可变结构域，人轻链恒定区(CL)，人重链恒定区2(CH2)和人重链恒定区3(CH3)；
[0018](ii)第二多肽，其从N至C端包含第一重链可变结构域，人重链恒定区1(CH1)，人重链恒定区2(CH2)和人重链恒定区3(CH3)；和
[0019](iii)通过第一接头与第一轻链可变结构域连接的第二轻链可变结构域，以及通过第二接头本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.分离的抗人EGFR(表皮生长因子受体)抗体，所述抗体包含重链和轻链，其中所述重链包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:22的互补决定区1(CDR1)，包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的CDR2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:24的CDR3。2.权利要求1的抗人EGFR抗体，其中所述重链包含SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:44的氨基酸序列。3.权利要求1或2的抗人EGFR抗体，其中所述轻链包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:26的CDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:27的CDR2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的CDR3。4.权利要求3的抗人EGFR抗体，其中所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:45。5.权利要求1或2的抗人EGFR抗体，其中所述轻链包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:31的CDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:32的CDR2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的CDR3。6.权利要求5的抗人EGFR抗体，其中所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:47。7.权利要求1或2的抗人EGFR抗体，其中所述轻链包括包含氨基酸序列SEQ ID NO:36的CDR1，包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的CDR2和包含氨基酸序列SEQ ID NO:38的CDR3...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈维灶，汪艳平，孝作祥，
申请(专利权)人：浙江时迈药业有限公司，
类型：发明
国别省市：