基于天然鸡源噬菌体库对抗孕酮scFv及其制备方法与应用技术

本发明专利技术一种基于天然鸡源噬菌体库对抗孕酮scFv及其制备方法与应用，旨在提供一种利用鸡源scFv天然噬菌体展示抗体库筛选孕酮获取单链抗体的方法；该方法是通过完全抗原(HT

【技术实现步骤摘要】
基于天然鸡源噬菌体库对抗孕酮scFv及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于免疫检测
，特别涉及一种基于天然鸡源噬菌体库对抗孕酮scFv的制备及应用。

技术介绍

[0002]孕酮，一种主要由卵巢分泌的糖皮质激素，作为常见的内分泌干扰物，对环境和人体都会造成一定危害。若检测到血清或牛奶中孕酮含量过低，牛有可能会流产，则可以通过适当补充孕酮来预防牛在怀孕早期流产，可挽回牛养殖业的巨大损失。
[0003]同时，检测牛奶制品中孕酮含量也是十分有意义的。女性儿童若长期饮用孕酮含量过高的牛奶制品，会导致性早熟，引发生理和心理各方面的问题。若检测到某品牌的牛奶制品含量过高，可避免购买该产品，减少了女性儿童性早熟的几率。所以奶制品中孕酮的检测显得尤为重要。
[0004]孕酮免疫分析快速检测技术是基于孕酮抗原和抗体的特异性结合而实现的，故抗体的制备是孕酮免疫快速检测的核心关键。传统抗体制备方法有多克隆抗体和单克隆抗体，均是通过免疫动物而制备的，但是，多克隆抗体不能保证批次与批次之间的一致性，而依赖杂交瘤细胞制备单克隆抗体这一技术生产成本高、耗时，且需要杂交瘤细胞的长期低温保存和定期驯化，但在这些过程中杂交瘤细胞会因保存条件不当，有效基因丢失或突变而无法产生有效的抗体。
[0005]随着基因工程技术的发展，序列明确的重组抗体逐渐变成研究热点，且开发具有优异性能的新型候选抗体一直是免疫测定的恒定目标。噬菌体抗体库技术的建立成为一种重组抗体的制备的替代工具。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种采用生物淘选的策略，基于天然鸡源噬菌体库对抗孕酮scFv的制备方法，该方法采用天然鸡源噬菌，通过天然鸡源噬菌大量无线表达获取，稳定生产。
[0007]本专利技术提供的另外一个目的是提供一种基于天然鸡源噬菌体库对抗孕酮scFv。
[0008]本专利技术提供的另外一个目的是提供上述基于天然鸡源噬菌体库对抗孕酮scFv的应用。
[0009]为此，本专利技术提供的第一个技术方案是这样的：
[0010]一种基于天然鸡源噬菌体库对抗孕酮scFv的制备方法，依次按照下述步骤制备：
[0011](1)抗孕酮scFv噬菌体展示文库的淘选：采用孕酮小分子竞争洗脱天然鸡源噬菌体的方法。
[0012](2)淘选结果的评估：采用间接phage
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ELISA的方法对第四轮淘选后得到噬菌体文库进行测定。
[0013](3)特异性单链抗体阳性克隆的筛选：采用间接phage
‑
ELISA的方法对第四轮淘选
后得到噬菌体文库进行测定；
[0014](4)阳性噬菌体的序列分析：将提取到的噬菌体粒送到公司进行测序。
[0015](5)抗孕酮特异性单链抗体的原核表达：构建目的基因载体pComb3x
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scFv，采用化学转化方法将目的载体pComb3x
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scFv转到表达型感受态细胞，进行scFv蛋白的原核表达和纯化。
[0016]优选的，步骤(1)所述抗孕酮scFv噬菌体展示文库的淘选具体按照以下步骤：用包被缓冲液稀释包被抗原(HT
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OVA/HT
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BSA)以及配置载体蛋白溶解液(OVA/BSA)进行包被，经脱脂奶粉封闭过后，加入构建好的天然鸡源噬菌体库展示单链抗体文库。将噬菌体文库溶液甩出，用PBST剧烈吹吸后，加入小分子标准品竞争洗脱，收集上清并转到载体蛋白包被板中孵育，收集上清进行扩大培养，得到的噬菌体再投入下一轮淘选。
[0017]筛选实验共进行四轮生物淘选，从第一轮到第四轮的淘选条件中，主要包括淘选包被抗原类型、包被抗原的浓度、小分子标准品竞争浓度、洗涤次数和Tween
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20的浓度，都比前一轮的淘选条件更加苛刻。
[0018]优选的，步骤(2)所述采用间接phage
‑
ELISA的方法对第四轮淘选后得到噬菌体文库进行测定。具体按照以下步骤：用HT
‑
BSA按照100uL/孔包被，经脱脂奶粉封闭过后，分别加入第一轮和第四轮筛选后的单链抗体噬菌体文库，通过添加HRP酶标二抗孵育，TMB显色，在酶标仪上读取吸光值。
[0019]优选的，步骤(3)所述采用间接phage
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ELISA的方法对第四轮淘选后得到噬菌体文库进行测定具体按照以下步骤：从第四轮筛选后噬菌体滴度板上，随机挑取单克隆菌落，接种到2mLLB培养基中，摇床振荡5
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6小时；取出1mL LB，加入10uL辅助噬菌体，37℃静置15min，使噬菌体完全侵染后。置于摇床振荡2小时后，加入卡那霉素，37℃振荡过夜。次日，12000rpm离心25min，收集噬菌体上清备用。
[0020]优选的，用HT
‑
BSA作为包被原，经过脱脂奶粉封闭后，加入100uL/孔噬菌体上清液，或者加入50uL/孔适当稀释的噬菌体上清液和等体积的孕酮标准品稀释液，混匀，37℃孵育1小时；加入抗M13
‑
HRP酶标二抗，37℃孵育1小时；加入TMB显色底物液后，加入2M浓硫酸终止反应，在酶标仪上读取吸光值。
[0021]优选的，步骤(4)所述阳性噬菌体的序列分析具体按照以下步骤：按照TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0说明书进行噬菌粒的提取，并将提取的噬菌粒送到生工生物工程(上海)股份有限进行测序，测序引物为G
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back，并使用DNAMAN对基因序列进行分析。
[0022]优选的，步骤(5)抗孕酮特异性单链抗体的原核表达具体按照以下步骤：基于步骤(4)，将2uL阳性噬菌粒pComb3x
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scFv加入100uL感受态细胞E.coli TOP10F
’
中，冰上孵育25min后，42℃水浴热激45s，迅速放回冰上并静置2min。向离心管加入不含抗生素无菌培养基，混匀后，37℃振荡1小时。吸取适量体积均匀涂布到含有抗生素的固体培养基中培养过夜。第二天，挑取单克隆进行培养，后加入IPTG进行诱导表达，使用细菌裂解液提取蛋白并通过镍柱纯化目的蛋白，采用SDS
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PAGE电泳测定蛋白分子量和纯度。
[0023]本专利技术提供的第二个技术方案是通过第一个技术方案制备的基于天然鸡源噬菌体库对抗孕酮scFv。
[0024]本专利技术提供的第三个技术方案是这样的：
[0025]一种基于孕酮特异性单链抗体建立酶联免疫分析方法，在优化条件下，使用梯度浓度的孕酮标准品建立竞争酶联免疫分析法，使用酶标仪测定吸光值，随后用Origin分析软件。
[0026]具体按照以下步骤：用包被缓冲液将包被抗原稀释至2ug/mL，以100uL/孔加入酶标板，4℃包被过夜，用PBST洗板3
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5次并拍干，使用3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于天然鸡源噬菌体库对抗孕酮scFv的制备方法，其特征在于：(1)抗孕酮单链抗体的生物淘选：采用交叉包被HT
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BSA/HT
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OVA完全抗原，孕酮小分子竞争洗脱，淘选条件逐渐苛刻策略进行四轮淘选；(2)序列明确的特异性抗孕酮单链抗体：测定第四轮筛选噬菌体滴度板中阳性单克隆菌落，通过噬菌体酶联免疫分析法进一步确定噬菌体的阳性效果，通过测序进一步分析和确定最优阳性单链抗体；(3)抗孕酮特异性单链抗体的原核表达：通过质粒提取获取噬菌粒，通过热激法将质粒转化到原核细胞，加入诱导剂进行单链抗体的原核表达。2.根据权利要求1所述的一种基于天然鸡源噬菌体库对抗孕酮scFv的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述噬菌体的生物淘选策略具体按照以下步骤：以HT
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OVA，HT
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BSA交叉包被，四轮包被抗原浓度依次是10、1、0.1、0.1ug/mL，孕酮标准品竞争浓度依次是100、10、1、0.1ug/mL，噬菌体洗涤次数依次为10、15、20、20次，PBST中吐温20质量百分比含量依次为0.05％、0.1％、0.5％、0.5％。3.根据权利要求1所述的一种基于天然鸡源噬菌体库对抗孕酮scFv的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述序列明确的特异性抗孕酮单链抗体具体按照以下步骤：用2ug/mL HT
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BSA作为包被抗原，经300uL 3％脱脂奶粉封闭后，加入100uL/孔噬菌体上清液，或者加入50uL/孔适当稀释的噬菌体上清液和等体积100ug/mL孕酮标准品稀释液，再加入抗M13
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HRP酶标二抗，检测吸光值；选定检测组吸光值比阴性组吸光值大于0.2以上单克隆细菌，以G
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back为...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵肃清，林明霞，何绮怡，卢明磊，崔锡平，
申请(专利权)人：广东工业大学，
类型：发明
国别省市：