使用修饰珠的小分子筛选细胞分析制造技术

一种筛选DNA编码的化学结构(2)文库在细胞靶标(11)中的活性的方法，其中所述文库的化学结构(2)、相应的编码DNA(4)和任选的对响应分子(12)敏感的化学探针(7/8/9)共价连接到珠子(1)上；该方法包括提供包含细胞靶标(11)和一个或多个如上定义的珠子(1)的孵育介质(13)或其等分试样，通过切割结构接头(3)从孵育介质(13)或其等分试样中的珠子(1)释放化学结构(2)并孵育释放的化学结构(2)和细胞靶标(11)；以及对珠子(1)上存在或保留的编码DNA进行测序。还提供了适用于该方法的珠子(1)。序。还提供了适用于该方法的珠子(1)。序。还提供了适用于该方法的珠子(1)。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用修饰珠的小分子筛选细胞分析


[0001]本专利技术涉及一种筛选在改变药学上感兴趣的细胞靶标的活性方面具有潜在功效的小分子的筛选分析，以及实施该分析的方法。

技术介绍

[0002]大多数药学上感兴趣的靶标在细胞环境中是活跃的。当研究改变靶标活性的小分子时，在细胞环境中这样做可能是有益的，包括在筛选大量不同的化合物时。
[0003]系统对靶标调节小分子的一个期望反应可能是从细胞中释放分子。这些分子可以是酶、蛋白质、核酸或细胞的较小产物，如代谢物。释放可以通过定向释放或简单的泄漏来实现。在筛选过程中，这些释放的分子将以化合物作用的手段被检测出来。
[0004]在制药工业的细胞的分析中筛选小分子化合物通常是通过将化合物和细胞组合在一个容器中来完成的(Jones E,Michael S,Sittampalam GS.Basics of Assay Equipment and Instrumentation for High Throughput Screening.2012 May 1[Updated 2016 Apr 2].In:Sittampalam GS,Coussens NP,Brimacombe K,et al.,editors.Assay Guidance Manual[Internet].Bethesda(MD):Eli Lilly&Company and the National Center for Advancing Translational Sciences；2004)。因此，小分子可以作用于细胞外或细胞膜中的细胞分子，或者它可以进入细胞并在细胞内执行其作用。然后通过监测可行的分析读数来确定化合物调节细胞活性的能力。这种分析读数可以是例如酶对底物的处理。底物的处理可产生荧光信号。另一种方法是，例如，通过改变荧光来监测小分子与蛋白质靶标的结合。
[0005]通过使用微隔室，例如以n孔板的形式(其中n通常为96、384或1536)，可以研究(＝筛选)大量不同的小分子其调节靶标活性或结合的能力。商业上可获得的微孔板读数器通常用于通过测量板中每个单独孔的剩余底物(或产品外观)来测量每个小分子的活性。另一种已知的将这种分析分成多个微隔室的方法是产生含有油包水乳液形式的分析试剂的水滴。
[0006]当使用微孔板读数器时，小分子板的长期储存的物流具有挑战性，尤其是在处理大量板时。此外，评估微孔板中产物形成所需的时间随着小分子的数量线性增加，这在研究数百万个小分子时是有问题的(使用目前的技术，评估200万个分子需要大约10个工作日)(Brouzes E.,Medkova M.,Savenelli N.,Marran D.,Twardowski M.,Hutchison J.B.,Rothberg J.M,Link D.R.,Perrimon N.,Samuels.M.L.,PNAS 106,pp.14195
‑
14200(2009))。
[0007]任何这样的分析都需要容易确定发现有用的化合物的结构。这个问题的一个解决方案是以DNA编码的化学库(DEL)的形式提供待筛选的化合物(Brenner and Lerner,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:5381
‑
5383(1992))。在DEL中，每种化合物都预先与对应于其结构的独特的DNA序列相连(标记)。因此，不需要鉴定有用化合物本身的结构(这项任务可能取决于结构，甚至是不可能的)，只需要对相应的DNA标签进行测序，这是对所有有用化合
物都相同的标准程序。
[0008]然而，这种基于DEL的分析滞后于与DNA标签相连的化合物在分析中的行为可能与游离化合物不同的问题。在WO 2018/087539中，建议在分析前切割化合物及其相连的DNA标签，但使游离化合物及其相连的DNA标签彼此“空间关联”。
[0009]ACS Chem.Biol.13,pp.761
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771(2018)公开了一种小分子分析，其使用带有淬灭的荧光团探针和附着于其上并具有DNA标签的小分子的二氧化硅珠。在该分析中，珠子渗透到细胞靶标中，从而其自身作为微隔室。通过光将小分子从穿透的珠子上切割下来。任何对细胞靶标致命的小分子都会导致其凋亡，释放半胱天冬酶
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3，并且在仍然渗透的珠子中，从荧光团中去除淬灭剂。使用流式细胞术分选出这些现在有荧光的细胞靶标(因此现在是荧光微隔室)，然后对包含在其中的任何珠子的DNA进行测序，以找出导致细胞凋亡的相应小分子。
[0010]US 5,958,703 A公开了一种带有可由报告分子修饰的系链的载体，以及相关的筛选方法。该公开“分离”具有修饰的系链的载体。因此，在用修饰的系链分离载体之前，该公开并未汇集所有载体。
[0011]WO 2013/057188 A1释放化合物，使得它们“保留在固体载体/珠子内部”或“每种化合物物理上位于其母体固体载体内部”或“释放在珠子内部”，或者甚至允许“底物”被“吸收到”载体/珠子中。因此，该公开没有将待分析的化合物释放到孵育介质中，而是将它们保留在珠子内。因此，该公开所针对的“理化或生物系统”是可溶的物质，而不是细胞靶标:在后一种情况下，将有两个异质相(含化合物的珠子和细胞靶标)，这将阻碍它们之间的相互作用。
[0012]ACS Comb.Sci.19,pp.524
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532(2017)描述了基于油包水液滴的分析原理。DNA编码文库的珠子被封装在液滴中，并在测试分析中孵育。任何在孵育分析中显示阳性反应的液滴(因此任何阳性微隔室)首先被分选出来，然后进一步检查从这些分选出来的液滴中分离的珠子是否是统计相关的命中。
[0013]ACS Comb.Sci.21,pp.425
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435(2019)也描述了一种基于油包水液滴的分析。DNA编码文库的珠子被封装在液滴中，并在自分泌运动因子抑制活性的筛选分析中孵育。该分析不使用细胞靶标，而是使用均匀溶解的自分泌运动因子作为靶标。该公开也是首先分选出命中的液滴:图1显示了使用荧光检测的“液滴分选连接(5)”。
[0014]在这些现有技术的基于珠子的分析中，首先选择或分选出“阳性”微隔室(如微孔、液滴、细胞或其他)，然后将分选出的微隔室中包含的所有珠子汇集在一起，并分析它们的DNA标签。然而，“阳性”微隔室可能包含一个以上的珠子，其中通常只有一个是命中的珠子(即提供活性小分子的珠子)，而其他珠子是非命中的珠子。前述公开将这些未命中的珠子指定为“乘客珠子”，并推导出了“错误发现率”的数学表达式描述此类未命中的珠子的分离和发现程度。只有在第二轮测试中，才能确认一个分离的珠子是未命中的珠子。
[0015]如下文所述，可以计算在此类现有技术分析中分离的珠子是命中的珠子的概率——P
h
。
[0016]微隔室中的珠群——P
b
是泊松分布的:
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于筛选DNA编码的化学结构文库(2)在细胞靶标(11)中的活性的方法；其中已知所述细胞靶标(11)在与活性化学结构接触时释放或改变响应分子(12)的释放；其中所述文库的化学结构(2)、对应的编码DNA(4)和任选的对响应分子(12)敏感的化学探针(7/8/9)共价连接到珠子(1)上，其中每个珠子(1)包括a)文库的一个单一化学结构(2)的多个实例，每个实例通过结构接头(3)共价连接到所述珠子(1)上，所述结构接头(3)可在可切割的结构接头位点(3a)处切割；和b)编码该化学结构(2)的DNA序列(4)的多个实例，每个DNA序列(4)通过标签接头(5)共价连接到所述珠子(1)上，所述标签接头(5)包含可切割的标签接头位点(5a)并可被切割剂(6)切割；其中在切割所述可切割标签接头位点(5a)的反应条件下，所述可切割结构接头位点(3a)是不可切割的，反之亦然；并且所述标签接头(5)和/或所述可切割的标签接头位点(5a)和/或所述DNA序列(4)任选地可被所述响应分子(12)切割；条件是，如果所述编码DNA序列(4)和/或所述可切割的标签接头位点(5a)和/或所述标签接头(5)可被响应分子(12)切割，那么所述珠子(1)优选没有响应分子敏感的化学探针(7/8/9)；该方法包括以下步骤:(i)要么(i
‑
a)为待分析的每个单独的化学结构(2)和每个单独的细胞靶标(11)提供包含所述细胞靶标(11)和一个或多个如上定义的珠子(1)的孵育介质(13)，所述珠子具有与其连接的那个单独的化学结构，通过在可切割的结构接头位点(3a)切割结构接头(3)从孵育介质(13)中的珠子(1)上释放所述化学结构(2)，并在孵育介质中孵育所述细胞靶标(11)和所述释放的化学结构(2)；或(i
‑
b)提供一种包含细胞靶标(11)和如上定义的所有珠子(1)的单一孵育介质(13)，使文库的所有化学结构(2)与其连接，从孵育介质中分离包含一个或多个珠子(1)的等分试样，通过在可切割结构接头位点(3a)切割结构接头(3)，在每个等分试样中从包含的珠子(1)中释放化学结构(2)，并在孵育介质(13)的等分试样中孵育所述细胞靶标(11)和所述释放的化学结构(2)；(ii)要么，如果编码DNA序列(4)和/或可切割的标签接头位点(5a)和/或标签接头(5)可被响应分子(12)切割，则:(ii
‑
a
‑
1)监控孵育介质(13)或其等分试样从任何珠子(1)中释放任何编码DNA序列(4)或其片段；并且如果是，则从所有孵育介质(13)或其所有等分试样中分离所有珠子(1)，并汇集所有分离的珠子(1)；(ii
‑
a
‑
2)汇集的珠子(1)中的可切割标签接头位点(5a)被切割剂(6)切割以释放任何编码DNA序列(4)或其片段；(ii
‑
a
‑
3)将释放的编码DNA序列(4)或其片段进行扩增和测序，以在其中鉴定DNA编码文库的任何完整DNA序列；和(ii
‑
a
‑
4)将未在步骤(ii
‑
a
‑
3)中鉴定的DNA编码文库的完整DNA序列的剩余部分与DNA编码文库的相应化学结构(2)相关联；
要么，如果珠子(1)包含对响应分子敏感的化学探针(7/8/9)，则:(ii
‑
b
‑
1)监控孵育介质(13)或其等分试样中任何探针(7/8/9)与响应分子(12)的任何反应或反应的变化，并且如果是这样，则从所有孵育介质(13)或其等分试样中分离所有珠子(1)并将其汇集；(ii
‑
b
‑
2)从所述汇集中提取显示所述探针反应或所述探针反应的变化的珠子(1)；(ii
‑
b
‑
3)从所述汇集中提取的珠子(1)中的可切割标签接头位点(5a)被切割剂(6)切割，以释放与分离的珠子(1)共价连接的任何DNA序列(4)；(ii
‑
b
‑
4)扩增并测序释放的DNA序列(4)；和(ii
‑
b
‑
5)将在步骤(ii
‑
b
‑
3)中测序的任何DNA序列与DNA编码文库的相应化学结构(2)相关联；和(iii)选择在步骤(ii
‑
a
‑
4)或(ii
‑
b
‑
5)中如此关联的任何化学结构(2)作为进一步的所述活性化学结构。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述孵育介质(13)或所述孵育介质(13)的等分试样具有平均珠群λ，定义...

【专利技术属性】
技术研发人员：亚历山大，
申请(专利权)人：弗，
类型：发明
国别省市：