用于鉴别牛樟芝菌株的方法技术

本发明专利技术涉及用于鉴别牛樟芝菌株的方法。本发明专利技术揭示一种用于鉴别牛樟芝菌株的方法，该方法包括：提供含有牛樟芝菌株的RPB2基因的DNA片段；以及将该DNA片段拿来与供比对的牛樟芝菌株的RPB2基因进行SNP基因分型，用来侦测这些牛樟芝菌株的RPB2基因的SNP位点上的碱基差异，其中，若存在有至少一个SNP位点上的碱基差异，表示这些牛樟芝菌株是彼此不同的分离株。表示这些牛樟芝菌株是彼此不同的分离株。

【技术实现步骤摘要】
polymerase II)的核基因(nuclear gene)，它所含有的12个高度保守的区域在真菌间具有85％以上的同一性(identity)，因此已有研究将RPB2基因应用于真菌的鉴别。例如，在Sung G.H.et al.(2007),Stud.Mycol.,57：5-59中，Sung G.H.等人使用RPB2、RPB1、nrLSU、细胞核核糖体小亚单元(nuclear ribosomal small subunit,nrSSU)、延长因子1-α(elongation factor 1-α,EF1-α)、β-微管蛋白(β-tubulin)以及粒线体ATP6(mitochondrial ATP6,atp6)中的5至7个基因来对冬虫夏草属(Cordyceps)与麦角菌科(Clavicipitaceae)进行亲缘关系的分析，借此而将冬虫夏草属重新分类并区隔为下列四个属：冬虫夏草属(Cordyceps)、鹿虫草属(Elaphocordyceps)、异虫草属(Metacordyceps)以及蛇形虫草属(Ophiocordyceps)；以及将麦角菌科重新分类并区隔为下列三个科：麦角菌科(Clavicipitaceae)、蛇形虫草科(Ophiocordycipitaceae)以及虫草菌科(Cordycipitaceae)。
[0006]而针对牛樟芝而言，已有研究尝试以ITS来鉴定牛樟芝菌株。例如，TW200912001A揭示一种用以鉴定牛樟芝菌株的方法，其主要是通过使用限制酶BvbI来对菌株的ITS基因的扩增产物进行切割，并利用能否切割来判断是否为牛樟芝菌株，还是其他同属不同种的菌株。在此件专利申请的实施例中，另外发现使用限制酶SapI来对ITS基因的扩增产物进行切割，则无法利用能否切割来区隔不同来源的6株牛樟芝菌株。
[0007]虽然已存在有上述的文献报导，就申请人所知，迄今尚无任何文献或专利在先申请曾经揭示RPB2基因可被应用于牛樟芝物种的菌株鉴别。因此，于本专利技术中，申请人意外地发现，通过比对牛樟芝菌株的RPB2基因中的碱基差异[也就是，单一核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)]来对牛樟芝菌株进行基因分型(genotyping)，能够有效地鉴别出不同的牛樟芝分离株。

技术实现思路

[0008]于是，本专利技术提供一种用于鉴别牛樟芝菌株的方法，该方法包括：提供含有牛樟芝菌株的RPB2基因的DNA片段；以及将该DNA片段拿来与供比对的牛樟芝菌株的RPB2基因进行SNP基因分型，用来侦测这些牛樟芝菌株的RPB2基因的SNP位点上的碱基差异，其中，若存在有至少一个SNP位点上的碱基差异，表示这些牛樟芝菌株是彼此不同的分离株。
[0009]本专利技术所述的方法，该SNP基因分型是通过使用下列方法学的至少之一来进行：测序、限制性片段长度多态性分析、寡核苷酸接合分析、分子信标、5
’-
核酸酶分析、动态等位基因-特异性杂交、SNP微阵列、DNA-DNA杂交以及变性梯度凝胶电泳。
[0010]本专利技术所述的方法，该至少一个SNP位点上的碱基差异存在选自于下列的RPB2基因的核苷酸残基位置：16、21、22、25、31、34、40、76、79、80、81、82、83、85、91、93、100、101、107、113、114、115、175、244、253、256、295、337、349、403、409、418、424、440、463、475、481、484、508、541、547、661、673、682、685、725、727、754、775、796、799、832、844、877、922、1066、1078、1085、1089、1096、1102、1105、1108、1113处，以及它们的组合。
[0011]本专利技术所述的方法，该至少一个SNP位点上的碱基差异存在选自于下列的RPB2基因的核苷酸残基位置：16、25、31、34、76、79、80、81、82、83、93、100、101、107、113、114、115、295、349、409、418、463、475、484、508、661、673、685、725、727、754、775、796、799、922、1066、1078、1105，以及它们的组合。
[0012]本专利技术所述的方法，该SNP位点上的碱基差异的侦测包括侦测下列的RPB2基因的核苷酸残基位置：16、25、31、295、349、418以及1105。
[0013]本专利技术所述的方法，该SNP位点上的碱基差异的侦测包括侦测下列的RPB2基因的核苷酸残基位置：16、25、31、295、349、463以及1105。
[0014]本专利技术所述的方法，该SNP位点上的碱基差异的侦测包括侦测下列的RPB2基因的核苷酸残基位置：16、25、31、295、349、475以及1105。
[0015]本专利技术所述的方法，该供比对的牛樟芝菌株选自于由下列所构成的群组：BCRC 35396、BCRC 35398、BCRC 37609、BCRC 37941，以及它们的组合。
具体实施方式
[0016]本专利技术的上述以及其它目的、特征与优点，在参照以下的详细说明与较佳实施例后，将变得明显。
[0017]为了本说明书的目的，将被清楚地了解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限于”，以及文字“包括(comprises)”具有对应的意义。
[0018]除非另外有所定义，在本文中所使用的所有技术性与科学术语具有本领域技术人员所共同了解的意义。本领域技术人员会认知到许多与那些被描述于本文中者相似或等效的方法和材料，它们可被用于实施本专利技术。当然，本专利技术决不受到所描述的方法和材料的限制。
[0019]如本文中所用的，“核酸”、“核酸序列”或“核苷酸序列”等术语意指呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸(deoxyribonucleotides)序列或核糖核苷酸(ribonucleotides)序列，且当中包含有已知的天然存在的核苷酸(naturally occurring nucleotides)或人造化学仿效物(artificial chemical mimics)。如本文中所用的，“核酸”此术语可与“基因”、“DNA”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”和“聚核苷酸”交换使用。
[0020]如本文中所用的，术语“DNA片段”与“核酸片段”可被互换地使用，并且意指一种DNA聚合物(DNA polymer)，该DNA聚合物是呈独立节段(separate segment)的形式或者是作为较大的DNA构建体(DNA construct)的组分(component)，其可以是衍生自经分离的DNA(isolated DNA)或是通过本
中所熟知的方法而被化学地或酶促地合成。
[0021]除非另有指明，核苷酸序列除了于本文中所揭示的特定序列外，也涵盖其互补序列(complementary sequences)，以及它们的保守性类似物(c本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴别牛樟芝菌株的方法，其特征在于：所述方法包括：提供含有牛樟芝菌株的RPB2基因的DNA片段；以及将所述DNA片段拿来与供比对的牛樟芝菌株的RPB2基因进行SNP基因分型，用来侦测所述牛樟芝菌株的RPB2基因的SNP位点上的碱基差异，其中，若存在有至少一个SNP位点上的碱基差异，表示所述牛樟芝菌株是彼此不同的分离株。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述SNP基因分型是通过使用下列方法学的至少之一来进行：测序、限制性片段长度多态性分析、寡核苷酸接合分析、分子信标、5
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核酸酶分析、动态等位基因-特异性杂交、SNP微阵列、DNA-DNA杂交以及变性梯度凝胶电泳。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述至少一个SNP位点上的碱基差异存在选自于下列的RPB2基因的核苷酸残基位置：16、21、22、25、31、34、40、76、79、80、81、82、83、85、91、93、100、101、107、113、114、115、175、244、253、256、295、337、349、403、409、418、424、440、463、475、481、484、508、541、547、661、673、682、685、725、727、754、775、796、799、832、844、877、922、1066、1078、1085、1089、1096、110...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢松源，詹馥菱，林宛柔，李涵荺，吴淑芬，陈庆源，
申请(专利权)人：财团法人食品工业发展研究所，
类型：发明
国别省市：