一种鉴定和/或区分甘蓝类蔬菜的InDel分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术属于分子遗传育种技术领域，尤其涉及一种鉴定和/或区分甘蓝类蔬菜的InDel分子标记及其应用。本发明专利技术在甘蓝C09染色体的WUSCHEL(WUS)基因的第二个外显子上筛选到一个InDel位点。在该InDel位点，结球甘蓝、球茎甘蓝和芥兰序列与野生甘蓝保持一致，而青花菜、花椰菜中存在12bp的缺失，缺失序列为TCATGTAGCCAT。在该InDel位点上下游200bp内用Primer 5设计了一对InDel标记引物，开发了InDel分子标记。本发明专利技术的分子标记及其引物对可为青花菜、花椰菜种质资源和品种鉴定提供依据。据。据。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定和/或区分甘蓝类蔬菜的InDel分子标记及其应用


[0001]本专利技术属于分子遗传育种
，尤其涉及一种鉴定和/或区分甘蓝类蔬菜的InDel分子标记及其应用。

技术介绍

[0002]甘蓝类蔬菜属于十字花科(Cruciferae)芸薹属(Brassica)，包括花椰菜(Brassica oleracea var.botrytis)、青花菜(Brassica oleracea var.italica)、结球甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)、球茎甘蓝(Brassica oleracea var.gongylodes)及芥兰(Brassica oleracea var.alboglabra)等，它们都有肥厚而呈蓝绿色的外叶，具明显的蜡粉和波状的叶缘，形态结构差异显著，由共同的祖先野生甘蓝(Brassica oleracea var.oleracea)通过人工栽培而来。甘蓝类蔬菜栽培历史长、种植面积大且在世界各地广泛种植，是重要蔬菜来源之一。其中青花菜和花椰菜以花球为产品，以其味道鲜美，营养丰富，倍受青睐。青花菜富含多种矿物质和维生素，富含萝卜硫苷，具有天然防癌和抗癌的功效，是一种极好的保健蔬菜。花椰菜富含蛋白质和多种矿物质，经常食用可清热解渴、利尿通便，同时含有“索弗拉芬”，对预防多种癌症起着积极作用。我国是青花菜和花椰菜生产大国，但优良的主栽品种大多从日本等地引进，种子价格昂贵。这也反映我国青花菜、西兰花的种业处于弱势地位，要积极加速推进我国优良品种选育的进程，使国产优良品种取代国外品种。市面上一些种子以次充好、以劣掺优，假种冒充真种的现象给我国青花菜、西兰花的种业发展造成了极大的不便。
[0003]品种鉴定是种质资源研究和利用的前提，能有效防止假冒伪劣产品流入市场，在遗传育种、农业生产上显得极为重要。甘蓝类物种常规鉴定主要采用植株形态鉴定和同工酶鉴定等方法。植株形态鉴定费时费力，周期长，且易受环境季节和鉴定者主观因素的影响。同工酶分析进行品种鉴定虽然已有许多成功的应用，但易受环境和所取材料部位的影响。分子标记辅助鉴定品种由于其高效、快捷、易操作且准确度高的特点被广泛应用。
[0004]刘广利用多态性引物RAPD(Random amplified polymorphic DNA)17个、ISSR(Inter
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simple sequence repeat)20个、SRAP(Sequence
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related amplified polymorphism)15对对33个甘蓝主栽品种及1个青花菜、1个花椰菜进行了品种鉴定，利用其中两个引物NAURPl068和me7
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1/emll
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1可将35个品种完全鉴别，三类标记聚类图谱均显示青花菜、花椰菜与甘蓝品种遗传关系较远(刘广，2007)；褚云霞利用筛选的36对SSR(Simple sequence repeats)引物对青花菜和花椰菜共计173份进行品种鉴定，结果显示该引物组合能将青花菜和花椰菜很好地区分开来，能鉴定绝大部分品种，其中有三个品种相似性为1，无法区分(褚云霞，2020)。王黎瑾利用17对SSR引物对29个青花菜品种进行品种鉴定，结果显示29个青花菜品种的SSR指纹图谱均具有唯一性(王黎瑾，2021)。虽然已有分子标记应用于甘蓝类蔬菜品种鉴定中，但前期要设计筛选的的引物对较多，且多是针对一类品种进行鉴定。因此在甘蓝类蔬菜中开发更多用于品种筛选早期鉴定且简单高效的分子标记迫在眉睫。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种鉴定和/或区分甘蓝类蔬菜的InDel分子标记及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
[0006]WUSCHEL(WUS)为WUSCHEL
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related homeobox(WOX)家族成员，主要在茎尖分生组织和花分生组织中表达，它的存在使周围细胞具有干细胞的特征。本申请在甘蓝C09染色体的WUSCHEL(WUS)基因的第二个外显子上筛选到一个InDel位点，在InDel上下游200bp内设计的一对标记引物，为青花菜、花椰菜的品种鉴定、辅助分子育种提供依据。
[0007]本专利技术是这样实现的，一种鉴定和/或区分甘蓝类蔬菜的InDel分子标记，所述InDel位于C09染色体的WUSCHEL基因的第二个外显子上，核苷酸序列为TCATGTAGCCAT。具体位置：野生甘蓝013基因组C09染色体上11,151,186bp处。
[0008]本专利技术还提供了检测如上述的InDel分子标记的引物组，包括正、反两条引物，核苷酸序列分别为F：GTCCATCCTCCACTTACGTTGT，R：ATGGTGCTCTTAATGCTTCTTCT。
[0009]本专利技术还提供了一种试剂盒，包含检测如上述的InDel分子标记的引物组。
[0010]进一步地，所述引物组包括正、反两条引物，核苷酸序列分别为F：GTCCATCCTCCACTTACGTTGT，R：ATGGTGCTCTTAATGCTTCTTCT。
[0011]进一步地，还包含Green Taq Mix。
[0012]本专利技术还提供了如上述的InDel分子标记、或引物组、或试剂盒在鉴定和/或区分甘蓝类蔬菜中的应用。
[0013]本专利技术还提供了一种鉴定和/或区分甘蓝类蔬菜的方法，对上述的InDel分子标记进行检测，缺失所示核苷酸序列的InDel分子标记的样品为青花菜或花椰菜。
[0014]进一步地，包含所示核苷酸序列的InDel分子标记的样品为结球甘蓝、或球茎甘蓝、或芥兰、或野生甘蓝。
[0015]进一步地，以蔬菜样品基因组DNA为模板，利用上述的引物组进行扩增，根据扩增结果判断样品类型。
[0016]进一步地，扩增结果出现约196bp条带时为青花菜或花椰菜；出现约208bp条带时为结球甘蓝、或球茎甘蓝、或芥兰、或野生甘蓝。
[0017]进一步地，PCR扩增反应体系包括：9.5μl ddH2O、12.5μl Green Taq Mix、1μl 10μM的正向引物、1μl 10μM的反向引物和1μl全基因组DNA组成。
[0018]进一步地，PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸15s，35个循环；72℃延伸7min。
[0019]综上所述，本专利技术的优点及积极效果为：
[0020]本专利技术在野生甘蓝C09染色体的WUSCHEL(WUS)基因的第二个外显子上筛选到一个InDel位点。在该InDel位点，结球甘蓝、球茎甘蓝和芥兰序列与野生甘蓝保持一致，而青花菜、花椰菜中存在12bp的缺失，缺失序列为TCATGTAGCCAT。
[0021]进一步开发了InDel分子标记，对48份野生甘蓝、84份花椰菜、168份青花菜、105份结球甘蓝、6份球茎甘蓝及10份芥兰这六类甘蓝类本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴定和/或区分甘蓝类蔬菜的InDel分子标记，其特征在于：所述InDel位于野生甘蓝013基因组C09染色体11,151,186bp处，核苷酸序列为TCATGTAGCCAT。2.检测如权利要求1所述的InDel分子标记的引物组，其特征在于，包括正、反两条引物，核苷酸序列分别为F：GTCCATCCTCCACTTACGTTGT，R：ATGGTGCTCTTAATGCTTCTTCT。3.一种试剂盒，其特征在于：包含检测如权利要求1所述的InDel分子标记的引物组。4.根据权利要求3所述的一种试剂盒，其特征在于：所述引物组包括正、反两条引物，核苷酸序列分别为F：GTCCATCCTCCACTTACGTTGT，R：ATGGTGCTCTTAATGCTTCTTCT。5.根据权利要求3所述的一种试剂盒，其特征在于：还包含Green Taq Mix。6.如权利要求1所述的InDel分...

【专利技术属性】
技术研发人员：伍晓明，龙莹，季高翔，李浩，马启铭，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：