表达嵌合抗原受体的γδT细胞制造技术

本发明专利技术涉及生物医药领域，具体而言，涉及一种表达嵌合抗原受体的γδT细胞。所述嵌合抗原受体包含A)抗原识别域，B)铰链区，C)跨膜域和D)胞内信号传导区；所述胞内信号传导区包括CD3ζ和共刺激域，所述共刺激域包括DAP10。DAP10共刺激域更加适合γδT细胞的CAR基因修饰，具有DAP10共刺激域的CAR

【技术实现步骤摘要】
表达嵌合抗原受体的
γδ
T细胞


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，具体而言，涉及一种表达嵌合抗原受体的γδT细胞。

技术介绍

[0002]γδT细胞是一群独特且保守的淋巴细胞，它们潜在的抗肿瘤活性，在最近引起了人们开发针对多种癌症的γδT细胞免疫疗法的巨大兴趣。
[0003]许多研究表明，用编码GD2或CD19特异性CARs的逆转录病毒载体转导的外周血来源的Vγ9Vδ2T细胞高表达CAR，易于扩增，并显示出抗原特异性IFN
‑
γ的分泌和对肿瘤细胞靶标的细胞毒性。这些体外试验表明，表达CAR的γδT细胞可作为有效的特异性抗肿瘤效应细胞。最近，Deniger等人进行的一项研究显示，在体外氨基双膦酸盐扩增的Vγ9Vδ2CAR
‑
T细胞可以分泌促炎细胞因子，在体外杀死CD19
+
肿瘤细胞系，并且也可以在小鼠异种移植模型中抑制肿瘤生长。除CAR介导的刺激外，γδTCR对肿瘤抗原的直接识别及其随后的信号级联反应可能对CAR
‑
γδT细胞具有叠加的刺激作用。
[0004]第二代CAR的胞内结构域包括共刺激结构域和第一刺激信号结构域。多项研究表明，不同共刺激域和CD3ζ的这些组合使第二代CAR优于第一代CAR。然而，CAR的第一刺激信号结构域CD3ζ和共刺激域的最佳组合仍有待确定。最常用的共刺激结构域来自CD28和4
‑
1BB，并已在几项研究中进行了比较，但是直到今天，结果仍存在争议。
[0005]此外，还有一个问题尚未解决，针对γδT细胞的CAR设计是否可能需要根据γδTCR分子结构和共刺激信号进行优化。研究表明，γδT细胞表达一系列共刺激分子，例如CD28，CD27和4
‑
1BB(CD137)。Ribot等人的研究表明CD28在γδT细胞上组成性表达，并通过产生IL
‑
2促进存活和增殖。在另一项研究中，DeBarros及其同事研究了CD27共刺激对人γδT细胞活化的影响。他们发现，使用可溶性重组CD70(CD27配体)可增强Vγ9Vδ2T细胞在体外的扩增能力。此外，CD27信号不仅促进细胞周期蛋白D2和抗凋亡基因调节剂Bcl2a1的上调，而且还诱导产生高水平的IFN
‑
γ。因此，应探索TCRγδ和CD27信号之间的协同作用，以用于Vγ9Vδ2T细胞的临床扩增。激活后的γδT细胞也表达CD137(4
‑
1BB)。有趣的是，Maniar等研究证明激活的Vγ9Vδ2T细胞表达高水平的CD137L，可以充当T细胞和NK细胞上CD137的配体，并且还可能通过逆转信号转导在Vγ9Vδ2T细胞激活中起作用。类似的可能性也可能适用于CD70，其在磷酸抗原刺激后在Vγ9Vδ2T细胞中的表达高度上调，但这需要进一步研究。宋等报道表达具有CD27信号域的CARs的αβT细胞表现出增殖能力的增强，Bcl
‑
XL的上调和对细胞凋亡的抵抗。他们的结果还表明，这些细胞对肿瘤的消退作用与CD28或CD137共刺激的CAR相似，并且体内持久性优于CD28和4
‑
1BB。
[0006]由此可见，目前针对γδT细胞的CAR结构的共刺激信号的选择还不明朗，难以实现所期望的抗肿瘤效果。
[0007]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0008]本专利技术的第一目的在于提供一种表达嵌合抗原受体的γδT细胞，所述嵌合抗原受体包含A)抗原识别域，B)铰链区，C)跨膜域和D)胞内信号传导区；
[0009]所述胞内信号传导区包括CD3ζ和共刺激域，所述共刺激域包括DAP10。
[0010]本专利技术的第二目的在于提供一种药用组合物，其包含如上所述的γδT细胞。
[0011]本专利技术的第三目的在于提供一种如上所述的γδT细胞在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
[0012]本专利技术通过对比几种常用的共刺激域组合，发现DAP10共刺激域更加适合γδT细胞的CAR基因修饰，具有DAP10共刺激域的CAR
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γδT细胞拥有更强的增殖能力和更长的存续持久性、肿瘤杀伤能力以及抗凋亡能力。
附图说明
[0013]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0014]图1为本专利技术一个实施例中CAR
‑
γδT制备流程图；
[0015]图2为本专利技术一个实施例中各组细胞在Day14和Day16的CAR表达情况；
[0016]图3为本专利技术一个实施例中各组细胞在有/无抗原刺激时的细胞数量；A，抗原刺激时，在Day10，Day17和Day25各组细胞的细胞数量；B，无抗原刺激时，在Day10，Day17和Day25各组细胞的细胞数量；
[0017]图4为本专利技术一个实施例中各组细胞在体外对CD19阳性和CD19阴性细胞的杀伤情况；A，不同效靶比(1：1，3：1和10：1)，各组细胞对Raji
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luc细胞的杀伤效果；B，不同效靶比(1：1，3：1和10：1)，各组细胞对K562
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luc细胞的杀伤情况；
[0018]图5为本专利技术一个实施例中评估嵌合共刺激受体(CCRs)结构杀伤Raji情况(效靶比1:1)。
具体实施方式
[0019]现将详细地提供本专利技术实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本专利技术。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本专利技术进行多种修改和变化而不背离本专利技术的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
[0020]除非另有说明，用于披露本专利技术的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本专利技术所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导，随后的定义用于更好地理解本专利技术的教导。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0021]本专利技术中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。
[0022]本专利技术中用端点表示的数值范围包括该范围内所包含的所有数值及分数，以及所引述的端点。
[0023]本专利技术涉及一种表达嵌合抗原受体的γδT细胞，所述嵌合抗原受体包含A)抗原识别域，B)铰链区，C)跨膜域和D)胞内信号传导区；
[0024]所述胞内信号传导区包括CD3ζ和共刺激域，所述共刺激域包括DAP10。
[0025本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.表达嵌合抗原受体的γδT细胞，所述嵌合抗原受体包含A)抗原识别域，B)铰链区，C)跨膜域和D)胞内信号传导区；所述胞内信号传导区包括CD3ζ和共刺激域，所述共刺激域包括DAP10。2.根据权利要求1所述的γδT细胞，所述DAP10氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。3.根据权利要求1所述的γδT细胞，其共刺激域还包括CD28、4
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1BB、OX40、ICOS、CD27、CD40
‑
MyD88、DAP12、2B4中的一种，或其任何组合中的任一种。4.根据权利要求3所述的γδT细胞，其共刺激域还包括CD28或4
‑
1BB；优选所述CD28氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；优选所述4
‑
1BB氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。5.根据权利要求1所述的γδT细胞，所述抗原识别域为特异性识别并结合如下抗原分子中的至少一种：α
‑
甲胎蛋白、α
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辅肌动蛋白
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4、A3、对A33抗体具有特异性的抗原、ART
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4、B7、Ba 733、BAFF
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R、BAGE、BCMA、BrE3抗原、CA125、CAMEL、CAP
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1、碳酸酐酶IX、CASP
‑
8/m、CCL19、CCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD56、CD59、CD64、CD66a/b/c/e、CD67、CD70、CD70L、CD74、CD79a、CD79b、CD80、CD83、CD95、CD117、CD123、CD126、CD132、CD133、CD138、CD147、CD154、CD319、CD371、CDC27、CDK
‑
4/m、CDKN2A、CTLA4、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF
‑
1α、结肠特异性抗原p(CSAp)、CEA、CEACAM
‑
6、c
‑
Met、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGP
‑
1、EGP
‑
2、ELF2
‑
M、Ep
‑
CAM、纤维母细胞生长因子、Flt
‑
1、Flt
‑
3、叶酸受体、G250抗原、GAGE、gp100、GRO
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β、GPRC5D、HLA
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DR、HM1.24、人绒毛膜促性腺激素(HCG)和它的亚单位、HER2/neu、HMGB
‑
1、缺氧诱导性因子(HIF
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1)、HSP70
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2M、HST
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2、Ia、IGF
‑
1R、IFN

【专利技术属性】
技术研发人员：罗敏，李光超，周兆，丁雯，
申请(专利权)人：广州百暨基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：