一种制备通用型人源化CAR19-DNT细胞的技术及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种制备通用型人源化CAR19-DNT细胞的技术及其应用。具体地，本发明专利技术提供了一种靶向CD19的通用型CAR-T细胞，所述通用型CAR-T细胞表达一外源的CAR构建物，所述CAR构建物具有如式I所示的结构，L-scFv-H-TM-C-CD3ζ

【技术实现步骤摘要】
一种制备通用型人源化CAR19-DNT细胞的技术及其应用


[0001]本专利技术属于肿瘤免疫细胞治疗
，具体涉及一种制备通用型人源化抗原嵌合受体CART-19细胞的技术方法及其应用。

技术介绍

[0002]嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor T，CART)是目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一，2017年已被美国FDA批准的2款CART细胞产品都是分离肿瘤患者自身的外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)细胞，通过基因工程嵌入特定的抗原受体(CAR)，使得PBMC中T细胞的靶向性、杀伤活性和持久性增强，其对肿瘤细胞表面抗原的识别不依赖MHC的限制性。常见的CAR由胞外抗原结合区、跨膜区、以及胞内的T细胞受体的信号转导区(如CD3ζ和CD28)组成。胞外抗原结合区由单克隆抗体的轻链(VL)和重链(VH)组成，中间由铰链连接形成单链抗体(single chain fragment variable，scFv)，能够识别特定的肿瘤抗原。CAR-T细胞技术已发展到第三代，第一代CAR由识别肿瘤表面抗原的单链抗体(scFv)抗原结合部位和免疫受体酪氨酸活化基序组成，胞外通过单链抗体(scFv)识别肿瘤标志分子，但是没有协同刺激信号，因此临床表现不佳，表现为T细胞体内存留时间短，细胞因子分泌能力低等问题；二代CART技术引入了共刺激信号序列，可提高T细胞的细胞毒活性、增殖能力以及体内存活时间、促进细胞因子的释放，在临床治疗急性淋巴细胞性白血病取得了成功；三代CART，在胞浆区串联排列了CD28、4-1BB两种协同刺激分子和CD3ζ分子，双共刺激的信号序列具有更好的效果。三代CART的结构示意图如图1所示。
[0003]目前自体CART细胞用于治疗靶向CD19的B细胞急性淋巴母细胞性白血病(B Acute Lymphoblastic cell Leukemia，B-ALL)，取得了高达90％以上的完全缓解率；在治疗淋巴瘤上，完全缓解率也高达64％；CART技术在治疗这两种疾病时取得的效果是任何其他药物无法相比的。在我国，急性淋巴细胞性白血病占儿童急性白血病的80％，发病率为十万分之一，占所有成年人白血病发病率的20％。免疫细胞治疗是许多严重疾病的重要治疗手段，包括癌症、自体免疫疾病甚至严重病毒感染都有使用免疫细胞治疗成功的案例。
[0004]虽然靶向CD19 CART在临床试验中的效果非常显著，但也存在诸多缺陷，除了会导致细胞因子风暴等严重副反应外，还存在4大问题：首先，一些淋巴细胞数量较低或质量较差的晚期患者，由于没有足够数量的自体免疫细胞，失去了CART治疗的机会；其次，已有报道采用病人自体细胞制备的CART产品时，将病毒基因转导到外周血残存肿瘤细胞内，导致病人死亡；再者，目前大部分正在开发的通用型CART细胞产品，是通过基因编辑技术敲除可以引起移植物抗宿主病的基因，如TCR受体等，但敲除这些基因需要繁琐的构建过程和大规模测序，并且脱靶率高；最后，由于制备自体CART细胞产品是1对1的个体化治疗，制备成本昂贵，制备工艺要求复杂，导致产品价格昂贵，大多病人无法承受，增加社会医疗负担。
[0005]因此，本领域迫切需要开发一种源自健康供者外周血，无需复杂基因编辑方法敲除引起移植物抗宿主病的TCR基因，免疫原性低(不引起宿主抗移植物免疫应答，体内存留
时间长)、安全性高、杀伤效果显著并且生产成本低的通用(即用)型CART细胞及其构建方法。

技术实现思路

[0006]鉴于现有相关技术的系列问题，本专利技术提供了一种制备通用型抗原嵌合受体CAR19-DNT细胞的技术方法及其应用。
[0007]本专利技术之目的是提供一种源自健康供者外周血，无需复杂基因编辑方法敲除引起移植物抗宿主病的TCR基因，免疫原性低(不引起宿主抗移植物免疫应答，体内存留时间长)、安全性高、杀伤效果显著并且生产成本低的通用(即用)型CART细胞及其构建方法。
[0008]在本专利技术的第一方面，提供了一种靶向CD19的通用型CAR-T细胞，所述通用型CAR-T细胞表达一外源的CAR构建物，所述CAR构建物具有如式I所示的结构，
[0009]L-scFv-H-TM-C-CD3ζ
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(式I)
[0010]式中，
[0011]L为无或信号肽序列；
[0012]scFv为靶向CD19的抗体单链可变区序列；
[0013]H为无或铰链区；
[0014]TM为跨膜结构域；
[0015]C为共刺激信号分子；
[0016]CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；
[0017]各
“-”
独立地表示连接上述各元件的连接肽或肽键。
[0018]在另一优选例中，所述靶向CD19的通用型CAR-T细胞是靶向CD19的通用型CAR-双阴性T细胞(CAR-DNT细胞)。
[0019]在另一优选例中，所述通用型CAR-T细胞中的TCR是敲除的或未敲除的。
[0020]在另一优选例中，所述通用型CAR-T细胞中的TCR未被敲除。
[0021]在另一优选例中，所述的L为选自下组蛋白的信号肽：CD8、GM-CSF、CD4、CD137、或其组合。
[0022]在另一优选例中，所述的L为CD8来源的信号肽。
[0023]在另一优选例中，所述scFv中包含具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的重链可变区(VH)和具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
[0024]在另一优选例中，所述scFv中还包含VH和VL之间的连接肽序列。
[0025]在另一优选例中，所述的连接肽序列具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
[0026]在另一优选例中，所述scFv具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
[0027]在另一优选例中，所述的H为选自下组蛋白的铰链区：CD8、CD28、CD137、或其组合。
[0028]在另一优选例中，所述的H为CD8来源的铰链区。
[0029]在另一优选例中，所述的TM为选自下组的蛋白的跨膜区：CD28、CD3 epsilon、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、或其组合。
[0030]在另一优选例中，TM包括CD8来源的跨膜区，和/或CD28来源的跨膜区。
[0031]在另一优选例中，所述的C为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：OX40、CD2、CD7、
CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB(CD137)、PD1、Dap10、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、NKG2D、GITR、TLR2、或其组合。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向CD19的通用型CAR-T细胞，其特征在于，所述通用型CAR-T细胞表达一外源的CAR构建物，所述CAR构建物具有如式I所示的结构，L-scFv-H-TM-C-CD3ζ
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(式I)式中，L为无或信号肽序列；scFv为靶向CD19的抗体单链可变区序列；H为无或铰链区；TM为跨膜结构域；C为共刺激信号分子；CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；各
“-”
独立地表示连接上述各元件的连接肽或肽键。2.如权利要求1所述的靶向CD19的通用型CAR-T细胞，其特征在于，所述靶向CD19的通用型CAR-T细胞是靶向CD19的通用型CAR-双阴性T细胞(CAR19-DNT细胞)。3.如权利要求1所述的靶向CD19的通用型CAR-T细胞，其特征在于，所述通用型CAR-T细胞中的TCR未被敲除。4.如权利要求1所述的靶向CD19的通用型CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR构建物具有如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。5.一种制备如权利要求1所述的靶向CD19的通用型CAR-DNT细胞的方法，其特征在于，包括步骤：(i)提供一表达载体，所述表达载体中含有编码如式I所示的CAR构建物的核苷酸序列；L-scFv-H-TM-C-CD3ζ

【专利技术属性】
技术研发人员：杨黎明，王丹，房康，李先才，
申请(专利权)人：浙江瑞加美生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：