一种大鼠软骨永生化细胞系的构建方法技术

本发明专利技术提供一种大鼠软骨永生化细胞系的构建方法，属于生物技术领域。本发明专利技术的方法构建hTERT和SV40LT慢病毒穿梭载体；通过体外感染大鼠原代软骨细胞，获得体外永生化的大鼠软骨细胞，为骨性关节炎的体外药效研究提供基础。础。

【技术实现步骤摘要】
h和72 h收集细胞上清液并用0.45 μm 滤器过滤，滤液经离心去除细胞碎片，上清液继续经超滤管浓缩和纯化至SV40LT过表达慢病毒滴度为：2.0
×
108TU/ml，hTERT过表达慢病毒滴度为：2.5
×
108TU/ml，获得病毒浓缩液。
[0008]上述步骤（6）中 Q
‑
PCR检测SV40LT基因和hTERT基因的引物序列如下：SV40LT
‑
F:5
’‑
GGCTACACTGTTTGTTGCCC
‑3’
；SV40LT
‑
R:5
’‑
AAGTTCAGCCTGTCCAAGGG
‑3’
；Htert
‑
F:5
’‑
AGGTGTCCCTGAGTATGGCT
‑3’
；Htert
‑
R:5
’‑
GAGTAGTCGCTCTGCACCTC
‑3’
；GAPDH
‑
F:5
’‑
GTGCCAGCCTCGTCTCATAG
‑3’
；GAPDH
‑
R:5
’‑
CTTTGTCACAAGAGAAGGCAG
‑3’
。
[0009]本专利技术的优点在于：本专利技术构建hTERT和SV40LT重组慢病毒穿梭载体，通过体外感染大鼠原代软骨细胞，获得体外永生化的大鼠软骨细胞，为骨性关节炎的体外药效研究提供基础。
[0010]附图说明：图1慢病穿梭载体PCDH
‑
CMV
‑
SV40LT
‑
EF1
‑
Puro的质粒图谱。
[0011]图2慢病穿梭载体PCDH
‑
CMV
‑
hTERT
‑
EF1
‑
Puro的质粒图谱。
[0012]图3 SV40LT/hTERT双标大鼠软骨永生化细胞镜下观察（P30代）。
[0013]图4 II型胶原法和阿利新蓝法染色法鉴定大鼠软骨细胞及永生化细胞。
[0014]图5 Q
‑
PCR检测大鼠软骨细胞中SV40LT和hTERT的过表达水平。
[0015]图6 β
‑
半乳糖苷酶染色法检测大鼠软骨衰老细胞。
具体实施方式
[0016]为了更好地理解本专利技术，下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步阐述，但并不是对本专利技术的限制。下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0017]实施例1 软骨细胞的分离培养4周龄SD大鼠4只，无菌条件下切取关节软骨，剪成1 mm3的大小，PBS洗涤3次，吸干PBS残液，加入含有0.2wt%的II型胶原酶消化液的培养皿，放入37℃的培养箱中，每隔2 h吸取上清液，1000 r/min的离心5min，弃消化液，收集细胞沉淀，更换消化液，重复4次。用5 ml DMEM培养液（10 vol%小牛血清、链霉素100 mg/L和青霉素100 U/ml）重悬细胞，全部接种于50 ml培养瓶中（原代），待细胞铺满培养瓶底部80%后，加入0.5
‑
1 ml 0.25%胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中，瓶口旋紧，放在倒置显微镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未飘起时将胰酶弃去，加入10 ml DMEM培养液终止消化。用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，旋紧瓶口，置于37℃下继续培养（F1代）。第二天观察贴壁生长情况。3天细胞可铺满培养瓶底部80%，细胞传至P3代。
[0018]实施例2 软骨细胞鉴定（1）II型胶原鉴定取对数期生长的F3代软骨细胞，按1
×
105个/ml接种于含有盖玻片的六孔板中，加入10vol%FBS （胎牛血清）DMEM培养基进行培养，待细胞爬满盖玻片后，按下述方法进行处理：
（1）PBS洗细胞爬片1遍，2 min；（2）4%多聚甲醛处理30 min（多聚甲醛室温，否则细胞会皱缩）；（3）PBS洗2遍，每遍2 min；（4）0.15% Txiton X
‑
100 室温处理10 min；（5）PBS洗2遍，每遍2 min；（6）加入适量的内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10分钟；（7）PBS洗2遍，每遍2 min；（8）用1%牛血清白蛋白（BSA）配制一抗：II型胶原蛋白（Collagen II）（1:200），37℃孵育2 h 或4℃过夜孵育；（9）PBS洗2遍，每遍2 min；（10）滴加反应增强液，室温处理20 min；（11）PBS洗2遍，每遍2 min；（12）滴加增强酶标山羊抗兔IgG聚合物，室温处理20 min；（13）PBS洗2遍，每遍2 min；（14）DAB显色液室温处理5
‑
8 min。
[0019]（2）阿利新蓝法染色取对数期生长的F3代软骨细胞，按1
×
105个/ml接种于含有盖玻片的六孔板中，加入10%FBS DMEM培养基进行培养，待细胞爬满盖玻片后，按下述方法进行处理：1、 4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤。
[0020]2、 加入阿利新蓝（Alcian）酸化液浸泡3 min。
[0021]3、 加入Alcian染色液染色30 min。
[0022]4、 PBS洗涤5 min。实施例3 大鼠软骨永生化细胞构建（1）实验材料实验试剂：仪器与设备：
载体系统：第三代慢病毒包装系统：包括pMDLg/pRRE（#ZVE1894，载基生物），pRSV
‑
Rev（#ZVE1049，载基生物），pMD2.G（#ZVE1890，载基生物）三种辅助质粒。
[0023]包装细胞株：293FT细胞（#ZCL1032，载基生物），为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM（含10 % FBS+1%双抗（青链霉素混合液（100
×
），其中青霉素10000 U/ml，链霉素10 mg/ml））。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。
[0024]（2）慢病毒包装实验步骤：重组质粒载体构建：由生物公司直接化学合成SV40LT和hTERT基因CDS区片段；SV40LT基因片段（2133 bp）和hTERT基因片段（3405 bp）；后利用如下引物进行PCR扩增获得目的基因，然后重组到目的载体PCDH
‑
CMV
‑
MCS
‑
EF1
‑
Puro（PCDH
‑
CMV
‑
MCS
‑
EF1
‑
Puro I酶切载体）中构建重组质粒，重组质粒经测序和双酶切鉴定（EcoRI
‑
BamHI，XbaI
‑
EcoRI），最终获得目的基因慢本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大鼠软骨永生化细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下具体步骤：（1）用含有0.2wt%的II型胶原酶消化大鼠关节软骨，提取并培养大鼠软骨细胞；（2）将P3代大鼠软骨细胞培养至对数期生长期，接种到6孔板，37℃培养过夜，接种细胞数量应保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率在50%以上；（3）病毒转染：取MOI值=10的病毒浓缩液和8 μg/ml 聚凝胺，加入已含有1 ml完全培养液的EP管中，混匀，得病毒稀释液；吸去步骤（2）培养板中的原培养基，沿壁加入病毒稀释液，勿吹起细胞；在水平方向轻轻拍打培养板，使每个孔中的溶液都混合均匀，然后把培养板放回37℃培养箱孵育；（4）感染6 h后，补充1 ml完全培养基，37℃过夜培养；（5）感染24 h后，吸去含病毒培养基，加入2 ml新鲜培养基，继续培养；（6）感染48
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72 h后， Q
‑
PCR检测SV40LT基因和hTERT基因的表达情况。2.根据权利要求1所述的一种大鼠软骨永生化细胞系的构建方法，其特征在于：步骤（3）中病毒浓缩液的制备方法为：将SV40LT和hTERT基因CDS区全片段接入PCDH
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CMV
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MCS
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EF1
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Puro载体中，构建慢病毒穿梭载体PCDH
‑
CMV
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SV40LT
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EF1
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Puro和PCDH
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CMV
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hTERT
‑
EF1
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Puro；后利用Lipo3000转染试剂，将...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈加守，林丽花，邱德辉，谢翔峰，
申请(专利权)人：福州载基生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：