一种大鼠软骨永生化细胞系的构建方法技术

本发明专利技术提供一种大鼠软骨永生化细胞系的构建方法，属于生物技术领域。本发明专利技术的方法构建hTERT和SV40LT慢病毒穿梭载体；通过体外感染大鼠原代软骨细胞，获得体外永生化的大鼠软骨细胞，为骨性关节炎的体外药效研究提供基础。础。

【技术实现步骤摘要】
h和72 h收集细胞上清液并用0.45 μm 滤器过滤，滤液经离心去除细胞碎片，上清液继续经超滤管浓缩和纯化至SV40LT过表达慢病毒滴度为：2.0
×
108TU/ml，hTERT过表达慢病毒滴度为：2.5
×
108TU/ml，获得病毒浓缩液。
[0008]上述步骤（6）中 Q
‑
PCR检测SV40LT基因和hTERT基因的引物序列如下：SV40LT
‑
F:5
’‑
GGCTACACTGTTTGTTGCCC
‑3’
；SV40LT
‑
R:5
’‑
AAGTTCAGCCTGTCCAAGGG
‑3’
；Htert
‑
F:5
’‑
AGGTGTCCCTGAGTATGGCT
‑3’
；Htert
‑
R:5
’‑
GAGTAGTCGCTCTGCACCTC
‑3’
；GAPDH
‑
F:5
’‑<br/>GTGCCA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大鼠软骨永生化细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下具体步骤：（1）用含有0.2wt%的II型胶原酶消化大鼠关节软骨，提取并培养大鼠软骨细胞；（2）将P3代大鼠软骨细胞培养至对数期生长期，接种到6孔板，37℃培养过夜，接种细胞数量应保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率在50%以上；（3）病毒转染：取MOI值=10的病毒浓缩液和8 μg/ml 聚凝胺，加入已含有1 ml完全培养液的EP管中，混匀，得病毒稀释液；吸去步骤（2）培养板中的原培养基，沿壁加入病毒稀释液，勿吹起细胞；在水平方向轻轻拍打培养板，使每个孔中的溶液都混合均匀，然后把培养板放回37℃培养箱孵育；（4）感染6 h后，补充1 ml完全培养基，37℃过夜培养；（5）感染24 h后，吸去含病毒培养基，加入2 ml新鲜培养基，继续培养；（6）感染48
‑
72 h后， Q
‑
PCR检测SV40LT基因和hTERT基因的表达情况。2.根据权利要求1所述的一种大鼠软骨永生化细胞系的构建方法，其特征在于：步骤（3）中病毒浓缩液的制备方法为：将SV40LT和hTERT基因CDS区全片段接入PCDH
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CMV
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MCS
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EF1
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Puro载体中，构建慢病毒穿梭载体PCDH
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CMV
‑
SV40LT
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EF1
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Puro和PCDH
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CMV
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hTERT
‑
EF1
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Puro；后利用Lipo3000转染试剂，将...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈加守，林丽花，邱德辉，谢翔峰，
申请(专利权)人：福州载基生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：