一株分泌氟啶胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用制造技术

一株分泌氟啶胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明专利技术提供了一株分泌氟啶胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株CKG，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年9月27日，保藏编号CGMCC No.20790。本发明专利技术将氟啶胺的完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化，通过颈背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。将高效价，低IC

【技术实现步骤摘要】
一株分泌氟啶胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用


[0001]本专利技术涉及一株分泌氟啶胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。

技术介绍

[0002]氟啶胺是由日本石原株式会社开发的2,6
‑
二硝基苯胺类杀菌剂，常用来防治番茄晚疫病，柑橘灰霉病，大豆菌核病，辣椒疫病以及十字花科植物的根肿病等。氟啶胺不内吸，不具治疗作用，但极耐雨水冲刷、残效长，是一种很好的叶面喷洒剂，并能兼治叶螨。但氟啶胺环境毒性让人担忧，有研究表明，氟啶胺可以引发哮喘病以及皮炎等破坏人体免疫系的疾病。因此，建立有效的氟啶胺残留检测方法，对有效促进环境保护，保障广大人民群众的身体健康，具有深远的意义。
[0003]目前，氟啶胺检测方法主要为仪器检测，常用的有气相色谱法、液相色谱法和气相色谱
‑
质谱法。如HPLC
‑
MS/MS法快速测定氟啶胺在马铃暮和土壤中残留（冯义志，金杰，潘金菊，齐晓雪，梁林，刘伟）Pesticide Science and Adminstration 2017,38(12)；其采用HPLC
‑
MS/MS法建立了马铃薯和土壤中氟啶胺的分析残留方法。尽管这些基于色谱的方法具有很高的灵敏度和特异性，存在一些缺点，例如需要彻底的样品净化，高溶剂消耗，昂贵的设备以及熟练的技术人员。因此，需要一种快速，简单的分析氟啶胺残留物的方法。
[0004]酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的前处理简单、纯化步骤少、分析容量大、检测成本低而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，因此在农药残留分析中得到了广泛应用。而使用酶联免疫法检测氟啶胺的前提是得到对氟啶胺具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对氟啶胺具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。
[0005]CN 110498766A公开了一种氟啶胺半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用，其以2,4
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二氯
‑
3,5
‑
二硝基三氟甲苯和2
‑
氨基丁酸甲 酯
‑3‑
氯
‑5‑
三氟甲基吡啶反应生成中间体，然后在水解获得氟啶胺半抗原，半抗原结构特征是在氟啶胺中间亚氨基的位置衍生出羧基。而本专利技术是直接在氟啶胺的基础上利用cl取代在氟啶胺的基础上衍生出羧基用于偶联蛋白。两个半抗原羧基的位置不同，因此暴露出的特异识别位点不同，因此也将产生亲和力，特异性和灵敏度不同的抗体。本专利技术的半抗原可以更好的暴露出氟啶胺的特异部分，实验结果也证明，本专利技术的抗体具有良好的亲和力，特异性和高灵敏度。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是克服上述不足之处，提供一种能分泌氟啶胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株。此杂交瘤细胞株分泌的氟啶胺单克隆抗体对氟啶胺具有较好的检测灵敏度（IC
50
值为2.68 ng/mL），可以用于建立氟啶胺的免疫学检测方法，检测食品中氟啶胺的残留。
[0007]本专利技术的技术方案，一株分泌氟啶胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株CKG，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3
号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年9月27日，保藏编号CGMCC No.20790。
[0008]本专利技术提供了上述一种分泌氟啶胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包含如下步骤：（1）制备氟啶胺半抗原及氟啶胺完全抗原，将获得的氟啶胺完全抗原制备成弗氏佐剂与不完全弗氏佐剂；（2）将得到的弗氏佐剂通过背部皮下注射，注射进入BALB/c小鼠体内进行多次免疫，首次免疫采用完全弗氏佐剂，加强免疫采用不完全弗氏佐剂；（3）将经过上述免疫过程的小鼠进行采血，通过间接ELISA检测小鼠血清免疫效价和免疫抑制能力，筛选出血清中氟啶胺抗体含量高的获得免疫的小鼠；（4）将筛选出的小鼠用不完全弗氏佐剂再进行最后一次加强免疫，然后通过腹腔注射进行冲刺免疫，冲刺免疫采用不含弗氏佐剂的氟啶胺完全抗原进行；（5）将进行冲刺免疫后的BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合，将融合的细胞通过培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行亚克隆，最终筛选出获得能分泌氟啶胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株CKG。
[0009]在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤（2）、（4）中的首次免疫与加强免疫之间间隔一个月，加强免疫之间间隔21天，加强免疫与冲刺免疫之间间隔18~21天。
[0010]在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤（2）、（4）中的首次免疫剂量为100μg/只，加强免疫剂量为50μg/只，冲刺免疫剂量为25μg/只。
[0011]在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤（2）、（4）中的免疫过程，包含1次首次免疫、4次加强免疫和1次冲刺免疫；在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤（3）中的采血为第3次免疫过程结束后第7天进行采血。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤（5）中的细胞融合是在冲刺免疫结束3天后进行。
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤（5）中的细胞融合是通过聚乙二醇（PEG4000）法进行的。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤（5）中的培养基为RPMI
‑
1640培养基。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤（5）中的亚克隆次数为3次。
[0016]所述氟啶胺半抗原的分子式如下：
；所述氟啶胺半抗原的制备方法，步骤如下：称取氟啶胺于反应容器中，用DMSO溶解，再加入KOH；另称取β
‑
巯基丙酸，用DMSO溶解；在搅拌下将β
‑
巯基丙酸溶液缓慢滴加到溶解后的氟啶胺中，于油浴上使之缓慢升温，保温后，撤去油浴；待产物自然冷却至室温后，加入水，采用HCl溶液调节pH值；将此混合液转移到分液漏斗中，用二氯甲烷分次提取，收集有机相；用NaHCO3水溶液分次洗涤二氯甲烷提取液，收集水相；用少量乙醚洗涤水相，弃去乙醚层；再用HCl溶液调节水相pH值，然后用乙酸乙酯分次萃取水相，合并乙酸乙酯提取液；用少量蒸馏水洗涤乙酸乙酯，弃水层；提取液经无水硫酸钠干燥后，减压浓缩，得少量黄色粘稠液体；加入少量丙酮溶液溶解，静置过夜，有黄色晶体析出，过滤即得到氟啶胺半抗原。
[0017]进一步地，具体步骤如下：称取氟啶胺9.30g于反应容器中，用20mL DMSO溶解，再加入KOH 2.25g；另称取β
‑
巯基丙酸2.10g，用10mL DMSO溶解并转移至50mL恒压滴液漏斗中；在搅拌下将β
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巯基丙酸溶液缓慢滴加到反应容器中，于油浴上使之缓慢升温至100℃，保温2h后，撤去油浴；待产物自然冷却至室温后，加入50mL本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株分泌氟啶胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株CKG，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年9月27日，保藏编号CGMCC No.20790。2.氟啶胺单克隆抗体，其特征在于：它由权利要求1所述保藏编号为CGMCC No. 20790的杂交瘤细胞株CKG分泌产生。3.氟啶胺半抗原，其特征在于分子式如下：。4.权利要求3所述氟啶胺半抗原的制备方法，其特征在于步骤如下：称取氟啶胺于反应容器中，用DMSO溶解，再加入KOH；另称取β
‑
巯基丙酸，用DMSO溶解；在搅拌下将β
‑
巯基丙酸溶液缓慢滴加到溶解后的氟啶胺中，于油浴上使之缓慢升温，保温后，撤去油浴；待产物自然冷却至室温后，加入水，采用HCl溶液调节pH值；将此混合液转移到分液漏斗中，用二氯甲烷分次提取，收集有机相；用NaHCO3水溶液分次洗涤二氯甲烷提取液，收集水相；用少量乙醚洗涤水相，弃去乙醚层；再用HCl溶液调节水相pH值，然后用乙酸乙酯分次萃取水相，合并乙酸乙酯提取液；用少量蒸馏水洗涤乙酸乙酯，弃水层；提取液经无水硫酸钠干燥后，减压浓缩，得少量黄色粘稠液体；加入少量丙酮溶液溶解，静置过夜，有黄色晶体析出，过滤即得到氟啶胺半抗原。5.根据权利要求4所述氟啶胺半抗原的制备方法，其特征在于步骤如下：称取氟啶胺6
‑
9g于反应容器中，用20
‑
40mL DMSO溶解，再加入KOH 2.5
‑
5g；另称取β
‑
巯基丙酸2
‑
4g，用5
‑
10mL DMSO溶解并转移至50mL恒压滴液漏斗中；在搅拌下将β
‑
巯基丙酸溶液缓慢滴加到反应容器中，于油浴上使之缓慢升温至100
‑
120℃，保温2
‑
4h后，撤去油浴；待产物自然冷却至室温后，加入20
‑
50mL水，以6 mol
ּ L
‑
1 HCl溶液调节pH值为2
‑
3；将此混合液转移到250mL分液漏斗中，用50
‑
100...

【专利技术属性】
技术研发人员：胥传来，刘杰，匡华，刘丽强，宋珊珊，胡拥明，徐丽广，胥欣欣，吴爱红，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：