杂交瘤细胞株及其产生的抗体和制备方法技术

本发明专利技术公开了杂交瘤细胞株1D11 1A5及其产生的抗体和制备方法。所述杂交瘤细胞株于2018年11月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16696。所述细胞株分泌单抗腹水纯化后得到的抗体间接ELISA效价为1:768000，抗体亚型为IgG2a，所述单抗可以特异识别原核表达的重组Cry2A蛋白及转基因水稻中的内源Cry2A蛋白，为转基因水稻中该蛋白的检测提供了物质和技术支撑。支撑。支撑。

【技术实现步骤摘要】
杂交瘤细胞株及其产生的抗体和制备方法
[0001]分案申请
[0002]本申请系申请号为201910201070.6、申请日为2019年03月18日、专利技术名称为“杂交瘤细胞株及其产生的抗体和制备方法”的母案中国专利申请的分案申请。


[0003]本专利技术涉及生物工程
，具体涉及到杂交瘤细胞株1D11 1A5及其产生的抗体和制备方法。

技术介绍

[0004]苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种广泛存在的革兰氏阳性菌，该菌分泌的抗虫晶体蛋白是目前主要的生物农药；分泌的抗虫蛋白按照氨基酸序列相似性被分为两类：Cry和Cryδ
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内毒素。其中Cry蛋白对多种有害昆虫(如鳞翅目，双翅目，鞘翅目，线虫类和原生生物等)幼虫具有毒性。Cry毒素已经被转入农作物使其具有抗虫性。Cry2A蛋白是Cry毒素中的一种。目前转Cry基因的农作物主要有玉米、土豆、水稻、棉花等。
[0005]转基因技术的发展与进步推动了生物学的发展。转基因食品虽然能够满足人们对产量、抗虫性等方面的要求，但同时也对人类的生活带来了一些潜在的威胁，如某些基因导入宿主之后会使食品产生毒性，转基因食物产生过敏原，使人产生抗药性，食品的营养价值发生改变等。在进行转基因食品研究开发和商业化的同时，为了对转基因食品的安全性给予综合评估，使消费者能够快速区分转基因食品与天然食品，建立合适的方法对转基因食品中转基因成分进行鉴定与检测，能够促进农业转基因生物安全管理，保障人和动物以及微生物的安全，同时能够保护生态环境，促进农业转基因生物技术的进一步研究。为了对转基因水稻或者其衍生物中Cry2A蛋白进行快速的定量或定性分析，研究并得到抗Cry2A蛋白的单克隆抗体具有非常大的意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种杂交瘤细胞株1D11 1A5和2G4 1B8及其产生的抗体和制备方法，其分泌的单抗为实现抗虫蛋白Cry2A在转基因水稻中的定性、定量检测奠定基础。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供了一种杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤：
[0008]a)通过原核表达得到Cry2A重组蛋白；
[0009]b)免疫动物：将Cry2A重组蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠；
[0010]c)细胞融合：收集免疫BALB/c小鼠的脾细胞并与SP2/0细胞进行融合；
[0011]d)细胞建株：通过有限稀释法进行亚克隆，亚克隆5
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7天进行ELISA检测，直至筛选出稳定分泌阳性抗体的杂交瘤细胞株进行扩大再培养和保存。
[0012]优选的，小鼠的脾细胞与SP2/0细胞的融合比例为1:5
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1:10。
[0013]本专利技术还提供了上述制备方法所制备出的杂交瘤细胞株，包括杂交瘤细胞株
1D111A5和杂交瘤细胞株2G4 1B8，已依次于2018年11月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。邮编：100101，保藏编号依次为CGMCC No.16696和CGMCCNo.16695。
[0014]本专利技术还提供了上述杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株1D111A5的生物保藏编号为CGMCC No.16696，所述杂交瘤细胞株2G4 1B8的生物保藏编号为CGMCC No.16695。
[0015]杂交瘤细胞株1D11 1A5以及杂交瘤细胞株2G4 1B8所产生的单克隆抗体的类型分别为IgG2a和IgG1。
[0016]杂交瘤细胞株1D11 1A5以及杂交瘤细胞株2G4 1B8所产生的单克隆抗体通过间接ELISA检测所得到的效价依次为1:768000和1:640000。
[0017]本专利技术还提供了上述单克隆抗体的制备方法，将杂交瘤细胞株接种到小鼠腹腔中制备腹水，然后进行Protein A
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琼脂糖亲和层析柱纯化，得到单克隆抗体。
[0018]本专利技术还提供了上述单克隆抗体在检测Cry2A抗虫蛋白中的应用。
[0019]本专利技术还提供了上述单克隆抗体在制备ELISA法检测Cry2A抗虫蛋白的试剂中的应用。
[0020]本专利技术还提供了上述单克隆抗体在制备ELISA双抗体夹心法检测Cry2A抗虫蛋白的试剂中的应用。
[0021]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本申请利用工程菌株表达、纯化得到的高纯度抗虫蛋白Cry2A作为抗原，通过杂交瘤技术制备了2株分泌抗Cry2A的特异、灵敏单抗的杂交瘤细胞株1D11 1A5以及杂交瘤细胞株2G41B8，所述细胞株分泌单抗腹水纯化后得到的抗体间接ELISA效价分别为1:768000和1:640000，抗体亚型分别为IgG2a和IgG1，所述单抗可以特异识别原核表达的重组Cry2A蛋白及转基因水稻中的内源Cry2A蛋白，分泌抗Cry2A抗虫蛋白的鼠单抗杂交瘤细胞株的构建为转基因水稻中该蛋白的检测提供了物质和技术支撑。
附图说明
[0022]图1为Cry2A重组蛋白SDS
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PAGE电泳结果图。
[0023]图2为Cry2A重组蛋白单抗筛选western结果图。
[0024]图3为杂交瘤细胞株1D11 1A5和2G4 1B8纯化的单克隆抗体的SDS
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PAGE电泳结果图。
[0025]图4为杂交瘤细胞株1D11 1A5所产生的单克隆抗体滴度。
[0026]图5为杂交瘤细胞株2G4 1B8所产生的单克隆抗体滴度。
[0027]图6为杂交瘤细胞株1D11 1A5所产生的单克隆抗体特异性检测Cry2A重组蛋白和转基因水稻中的Cry2A Western结果图。
[0028]图7为杂交瘤细胞株2G4 1B8所产生的单克隆抗体特异性检测Cry2A重组蛋白和转基因水稻中的Cry2A Western结果图。
具体实施方式
[0029]下面结合附图，对本专利技术的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本专利技术的保
护范围并不受具体实施方式的限制。
[0030]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径可购得。
[0031]实施例1杂交瘤细胞获得及其单克隆抗体的制备
[0032]1.免疫抗原的制备
[0033]1.1重组蛋白Cry2A表达菌株构建、菌体培养及裂解
[0034]Cry2A编码基因扩增：以转基因水稻T1C
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19基因组DNA为模板，Cry2A
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NdeI
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F:catatgaacaacgtgctgaacagc和Cry2A
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XhoI
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R:ctcgagttagtagagtggcggcag为引物，用高保真Fastpfu进行PCR扩增，扩增到的PCR产物经(1.0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株于2018年11月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16696。2.根据权利要求1所述杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体，其特征在于，将所述杂交瘤细胞株接种到小鼠腹腔中制备腹水，然后...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘卫晓，金芜军，张哲，高进，董美，王迪，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：