一株苋菜红、胭脂红单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用制造技术

一株苋菜红、胭脂红单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明专利技术合成了苋菜红、胭脂红半抗原，制备了苋菜红、胭脂红完全抗原，并将它与等量弗氏佐剂混合乳化完全，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠，首次免疫用弗氏完全佐剂，多次加强免疫用弗氏不完全佐剂，最后一次用苋菜红、胭脂红完全抗原冲刺免疫。取高效价、低IC

【技术实现步骤摘要】
一株苋菜红、胭脂红单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用


[0001]本专利技术涉及一株苋菜红、胭脂红单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。

技术介绍

[0002]苋菜红、胭脂红是目前我国批准使用的偶氮类人工合成色素。苋菜红、胭脂红作为食品色素可少量用于果汁饮料、蜜饯、碳酸饮料、糖果、蜜饯等食品的着色，而不能用于肉类及其加工品、水产品及其加工品调味品婴儿食品中。苋菜红、胭脂红在体内的代谢产物为芳香胺类化合物，芳香胺类化合物在体内经过代谢活动后与靶细胞作用可能引起肿瘤。长期食用含苋菜红、胭脂红这两个合成的偶氮染料超标的食品可能危害人体健康，引起部分人群过敏和哮喘，诱发癌症和其他疾病。因此，有必要建立快速、高效的食品中苋菜红、胭脂红的检测方法。
[0003]苋菜红、胭脂红含量分析方法有近红外广谱法、高效液相色谱法(HPLC)、液质联用 (LC
‑
MS)等仪器方法，这些检测方法具有耗时、步骤繁琐、无法进行现场快速检测、成本高等缺点，因此建立快速简便的苋菜红、胭脂红检测方法具有重要意义。酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，适用于大量样本的现场快速检测，为苋菜红、胭脂红检测提供了一种新的检测途径。
[0004]CN 102313804 A公开了一种用于检测苋菜红的方法及酶联免疫试剂盒，其所提供的检测苋菜红的酶联免疫试剂盒，包括苋菜红半抗原和苋菜红的特异性抗体；所述特异性抗体为所述苋菜红的多克隆抗体或单克隆抗体。
[0005]CN 102313807 A公开了一种用于检测胭脂红的方法及酶联免疫试剂盒，其所提供的检测胭脂红的酶联免疫试剂盒，包括胭脂红半抗原和胭脂红的特异性抗体；所述特异性抗体为所述胭脂红的多克隆抗体或单克隆抗体。
[0006]上述现有技术均采用酶联免疫法（ELISA），但均未公开采用的半抗原具体结构，且其灵敏度相对于本专利技术较低，并且不能够同时检测苋菜红和胭脂红。
[0007]日落黄和胭脂红酶联免疫吸附测定法的建立（南开大学，邢玥）涉及了一种日落黄及胭脂红结构类似物作为半抗原，其中胭脂红检测方法的灵敏度为36.82ng/mL，建立方法的标准曲线方程为y=0.981550.15373x，工作范围是1
‑
1000ng/L；其灵敏度远低于本专利技术。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是克服上述不足之处，提供一株苋菜红、胭脂红单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，苋菜红、胭脂红单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体可制成用于检测苋菜红、胭脂红的试剂盒，具有实际应用价值。
[0009]本专利技术的技术方案，一株苋菜红、胭脂红单克隆抗体杂交瘤细胞株DAS 3H10，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年9月27日，保
藏编号CGMCC No.20789。
[0010]苋菜红、胭脂红单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No.20789的杂交瘤细胞株DAS 3H10分泌产生。
[0011]苋菜红、胭脂红半抗原，具体为AMA
‑
COOH，合成路线如下所示：。
[0012]所述苋菜红、胭脂红半抗原的制备方法，步骤如下：称取化合物14
‑
氨基
‑1‑
萘甲酸，加入盐酸，滴加NaNO2至淀粉碘化钾试纸变蓝后继续反应，得到A液；向化合物2 3
‑
羟基
‑
2,7
‑
萘二磺酸二钠中滴加无水乙醇至3
‑
羟基
‑
2,7
‑
萘二磺酸二钠全部溶解，得到B液；向B液体中缓慢滴加A液，用NaOH调pH呈碱性，立即产生大量絮状沉淀，继续反应一段时间后离心沉淀，干燥后得到化合物3，即为半抗原AMA
‑
COOH。
[0013]进一步地，所述苋菜红、胭脂红半抗原的制备方法，步骤为：称取1870
‑
200 mg化合物1 4
‑
氨基
‑1‑
萘甲酸，加入4
‑
5 mL 1 M的盐酸，滴加NaNO2至淀粉碘化钾试纸变蓝后4℃继续反应20
‑
30 min，得到A液；向340
‑
350 mg化合物2 3
‑
羟基
‑
2,7
‑
萘二磺酸二钠滴加无水乙醇至3
‑
羟基
‑
2,7
‑
萘二磺酸二钠全部溶解，得到B液；向B液体中缓慢滴加A液，用NaOH调pH 8
‑
9，立即产生大量絮状沉淀，继续反应1
‑
2 h后离心沉淀，干燥后得到红色粉末化合物3，即为半抗原AMA
‑
COOH。
[0014]苋菜红、胭脂红完全抗原的制备方法，具体包括免疫原和包被原；进一步地，所述免疫原制备过程为：称取苋菜红、胭脂红半抗原AMA
‑
COOH，1
‑
乙基碳二亚胺盐酸盐和N
‑
羟基琥珀酰亚胺，用无水N,N
‑
二甲基甲酰胺溶解，得到A1液，室温搅拌反应；取牛血清蛋白BSA，用硼酸盐缓冲溶液溶解，得到B1液，在室温条件，将A1液加入到B1液中，室温反应，即得偶联物AMA
‑
COOH
‑
BSA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，得到偶联物AMA
‑
COOH
‑
BSA；进一步地，所述包被原制备过程为：称取苋菜红、胭脂红半抗原AMA
‑
COOH，1
‑
乙基碳二亚胺盐酸盐和N
‑
羟基琥珀酰亚胺，用无水N,N
‑
二甲基甲酰胺溶解，得到A2液，室温搅拌反应；称取鸡卵清白蛋白OVA，溶解于硼酸盐缓冲溶液中，得到B2溶液，在室温条件下，将A2液加入到B2液中，室温反应12h，即得偶联物AMA
‑
COOH
‑
OVA混合液，通过透析分离包被原和未偶联的小分子半抗原。
[0015]所述苋菜红、胭脂红完全抗原的制备方法，所述免疫原的制备过程为：称取9
‑
10 mg苋菜红、胭脂红半抗原AMA
‑
COOH，1
‑
乙基碳二亚胺盐酸盐10
‑
15 mg和N
‑
羟基琥珀酰亚胺6
‑
7 mg，用500
‑
600 μL无水N,N
‑
二甲基甲酰胺溶解，得到A1液，室温搅拌反应6
‑
8 h；称取10
‑
15 mg牛血清蛋白BSA，用2 mL 0.1M硼酸盐缓冲溶液溶解，得到B1液；在室温条件，将A1...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株苋菜红、胭脂红单克隆抗体杂交瘤细胞株DAS 3H10，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2020年9月27日，保藏编号CGMCC No.20789。2.苋菜红、胭脂红单克隆抗体，其特征在于：它由权利要求1所述保藏编号为CGMCC No.20789的杂交瘤细胞株DAS 3H10分泌产生。3.苋菜红、胭脂红半抗原，其特征在于：具体为AMA
‑
COOH，合成路线如下所示：。4.权利要求3所述苋菜红、胭脂红半抗原的制备方法，其特征在于步骤如下：称取化合物14
‑
氨基
‑1‑
萘甲酸，加入盐酸，滴加NaNO2至淀粉碘化钾试纸变蓝后继续反应，得到A液；向化合物2 3
‑
羟基
‑
2,7
‑
萘二磺酸二钠中滴加无水乙醇至3
‑
羟基
‑
2,7
‑
萘二磺酸二钠全部溶解，得到B液；向B液体中缓慢滴加A液，用NaOH调pH呈碱性，立即产生大量絮状沉淀，继续反应一段时间后离心沉淀，干燥后得到化合物3，即为半抗原AMA
‑
COOH。5.根据权利要求4所述苋菜红、胭脂红半抗原的制备方法，其特征在于步骤为：称取180
‑
200 mg化合物1 4
‑
氨基
‑1‑
萘甲酸，加入4
‑
5 mL 1 M的盐酸，滴加NaNO2至淀粉碘化钾试纸变蓝后4℃继续反应20
‑
30 min，得到A液；向340
‑
350 mg化合物2 3
‑
羟基
‑
2,7
‑
萘二磺酸二钠滴加无水乙醇至3
‑
羟基
‑
2,7
‑
萘二磺酸二钠全部溶解，得到B液；向B液体中缓慢滴加A液，用NaOH调pH 8
‑
9，立即产生大量絮状沉淀，继续反应1
‑
2 h后离心沉淀，干燥后得到红色粉末化合物3，即为半抗原AMA
‑
COOH。6.苋菜红、胭脂红完全抗原的制备方法，其特征在于：具体包括免疫原和包被原；所述免疫原制备过程为：称取苋菜红、胭脂红半抗原AMA
‑
COOH，1
‑
乙基碳二亚胺盐酸盐和N
‑
羟基琥珀酰亚胺，用无水N,N
‑
二甲基甲酰胺溶解，得到A1液，室温搅拌反应；取牛血清蛋白BSA，用硼酸盐缓冲溶液溶解，得到B1液，在室温条件，将A1液加入到B1液中，室温反应，即得偶联物AMA
‑
COOH
‑
BSA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，得到偶联物AMA
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：胥传来，晁梦佳，匡华，徐丽广，刘丽强，宋珊珊，胡拥明，吴晓玲，吴爱红，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：