用于检测犬圆环病毒抗原的免疫层析试剂条及其制备方法技术

技术编号:30228229 阅读:21 留言:0更新日期:2021-09-29 09:56
本发明专利技术公开了用于检测犬圆环病毒抗原的免疫层析试剂条及其制备方法,属于体外免疫诊断检测工具技术领域,包括PVC底板,其特征在于:还包括依次粘贴在PVC底板上的吸水垫、硝酸纤维素膜、标记垫和样品垫;所述标记垫上喷有CanineCV抗体

【技术实现步骤摘要】
用于检测犬圆环病毒抗原的免疫层析试剂条及其制备方法


[0001]本专利技术涉及体外免疫诊断检测工具
,具体属于用于检测犬圆环病毒抗原的免疫层析试剂条及其制备方法。

技术介绍

[0002]犬圆环病毒(Canine Circovirus,CanineCV)是一种单链环状无囊膜DNA病毒,属于新发现的哺乳动物圆环病毒,2012年首次在美国犬血清中发现。犬圆环病毒属于圆环病毒科,圆环病毒属还包括猪圆环病毒2型,鸭圆环病毒、鹅圆环病毒、金丝雀圆环病毒、禽白血病病毒等。犬圆环病毒基因组大小约为2063nt,比圆环病毒2的基因多276~277nt。犬圆环病毒有两个开放阅读框,ORF1开放阅读框相对比较保守一些,ORF2变异程度相对比较大。ORF1开放阅读框有 912个碱基,编码犬圆环病毒的复制酶,与该病毒的复制有关;第二个开放阅读框ORF2主要编码衣壳蛋白。目前,犬圆环病毒在意大利、德国和中国大陆均有检出,宿主除了家犬外还有狼、狐、獾等犬科野生动物。
[0003]临床上,CanineCV感染与犬血管炎、出血性腹泻和胃肠炎有关。病毒主要存在于肠道内部,有的还存在于肝脏、脾脏和淋巴等组织内部。犬圆环病毒的临床症状与圆环2型引起的猪的皮炎与肾病综合征在临床症状和病理变化上都非常相似。根据犬圆环病毒的基因序列设计出了特异性引物进行PCR方法检测,在患有腹泻的犬中犬圆环病毒的检出率达到20.1%,健康组的犬中,犬圆环病毒的检出率只有7.3%。这样检测侧CanineCV抗原不但相当耗时、耗费精力,成本高,并且检出率还很低,十分不利于该疾病的及时诊断和研究,甚至耽误宝贵的治疗时机。因此,亟需检出率高且快速的检测手段对CanineCV抗原进行及时的检测。
[0004]虽然,犬圆环病毒越来越受到人们的关注,但目前关于CanineCV 的研究很少,一直没有成功研发出快速检测CanineCV抗原的试纸条。并且,2016年我国学者首次在大陆从犬血清中检测到犬圆环病毒,经过进化树分析发现,我国发现的犬圆环病毒与欧美各国发现的毒株属于不同的进化分枝。因此,该病毒研究起来极其困难,试验需要考虑的因素太多,例如目前一直无法研发出有效的标记方法和复合溶液,一个小条件也会影响胶体金的复溶效果,进而影响最终的检测性能,即使做无数试验也无法成功,也难以实现检测的重复性。
[0005]目前为止,关于该病毒流行病学、基因分型、致病性和机制研究等仍处于空白,国内还没有快速检测犬圆环病毒的试剂,对CanineCV 疫病防控及其流行病学调查也受到阻碍,停滞不前。

技术实现思路

[0006]针对
技术介绍
中存在的缺陷和不足,本专利技术提供了用于检测犬圆环病毒抗原的免疫层析试剂条,能够对CanineCV进行现场快速检测,填补了国内尚无CanineCV抗原快速检测试剂的空白,且检出率高。
[0007]本专利技术的目的之二是提供一用于检测犬圆环病毒抗原的免疫层析试剂条的制备方法,该制备方法能够有效进行复合物的标记,保障胶体金的复溶效果,使得制备出的试剂条能够对CanineCV抗原进行现场快速检测,且检出率高,重复性强。
[0008]为实现上述目的,本专利技术采用以下技术方案予以实现:
[0009]用于检测犬圆环病毒抗原的免疫层析试剂条,包括PVC底板,还包括依次粘贴在PVC底板上的吸水垫、硝酸纤维素膜、标记垫和样品垫;
[0010]所述样品垫设置在所述PVC底板的一端上;所述样品垫设有样品滴入区;所述样品垫的一端搭设在所述标记垫上,所述标记垫上喷有 CanineCV抗体

胶体金复合物,远离所述样品垫的所述标记垫一端搭设在硝酸纤维素膜上;所述硝酸纤维素膜固定连接在PVC底板上,所述硝酸纤维素膜上包被有质控线C、检测线T,所述质控线C与检测线T相互平行,并垂直于试纸条延长方向设置;所述质控线C包被有 CanineCV重组抗原;所述检测线T包被有CanineCV抗体;远离所述样品垫的所述硝酸纤维素膜一端搭设在吸水纸下。
[0011]进一步所采取的措施是:所述标记垫上的CanineCV抗体

胶体金复合物喷量为2~4μl/cm,胶体金标记CanineCV抗体的比例为每毫升标记量为5~10μg,CanineCV抗体

胶体金复合物浓缩倍数为20~ 30倍,即每20~30ml胶体金浓缩至1ml,喷量为2~4μl/cm。
[0012]进一步所采取的措施是:所述硝酸纤维素膜上的检测线T包被的CanineCV抗体的浓度为0.5~1.0mg/ml,划线量为1.0~2.0μl/cm;所述的质控线C包被的CanineCV抗原的浓度为1.0~2.0mg/ml,划线量为1.0~2.0μl/cm。
[0013]进一步所采取的措施是:所述胶体金粒径为20

50nm。
[0014]用于检测犬圆环病毒抗原的免疫层析试剂条的制备方法,包括下列步骤:
[0015](1)胶体金溶液的制备;
[0016](2)标记垫的制备,包括CanineCV抗体

胶体金复合物的制备,取1ml的胶体金溶液,加入2~10μl的0.1mol/l K2CO3溶液混匀,加入5~10μg CanineCV抗体混匀15min,再加入50~100μl的10% BSA溶液进行封闭10min,置于冷冻离心机内4℃,10000rpm离心 30min,弃上清液,沉淀用胶体金复溶液复溶至30~50μl,2~8℃储存备用;
[0017](3)包被质控线C、检测线T;
[0018](4)样品垫的预处理;
[0019](5)切割与组装;得到成品。
[0020]进一步所采取的措施是:所述的胶体金复溶液含有pH8.2的 0.02mol/l Tris缓冲液、0.1%Casein、0.3%~0.5%PVP40、2~5%海藻糖混合液。
[0021]进一步所采取的措施是:所述步骤(1)中的制备过程包括,称取100ml超纯水至锥形瓶内,加入1.0ml 1%氯金酸溶液至锥形瓶中混匀,加热至沸腾时,迅速加入适量1%柠檬酸三钠,观察溶液颜色变化,待颜色稳定不变后,继续加热5分钟,然后停止加液,将溶液冷却至室温后,置于2~8℃保存。
[0022]进一步所采取的措施是:所述步骤(2)还包括S2、喷金,使用三维喷金划膜仪将CanineCV抗体

胶体金复合物喷至标记垫上,喷量为2~4μl/cm;将喷好的标记垫置于干燥室(湿度<30%)干燥12h 后,加入干燥剂封口备用。
[0023]进一步所采取的措施是:所述步骤(4)的处理过程包括,将样品垫用样品垫预处理液浸泡30min,沥干后置于干燥室(湿度<30%) 干燥12h后,加入干燥剂封口备用;
[0024]所述样品垫预处理液含有pH 7

9,Tris

Hcl缓冲液、0.5%吐温 20、0.5%海藻糖的混合液。
[0025]进一步所采取的措施是:所述步骤(3)本文档来自技高网
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测犬圆环病毒抗原的免疫层析试剂条,包括PVC底板,其特征在于:还包括依次粘贴在PVC底板上的吸水垫、硝酸纤维素膜、标记垫和样品垫;所述样品垫设置在所述PVC底板的一端上;所述样品垫设有样品滴入区;所述样品垫的一端搭设在所述标记垫上,所述标记垫上喷有CanineCV抗体

胶体金复合物,远离所述样品垫的所述标记垫一端搭设在硝酸纤维素膜上;所述硝酸纤维素膜固定连接在PVC底板上,所述硝酸纤维素膜上包被有质控线C、检测线T,所述质控线C与检测线T相互平行,并垂直于试纸条延长方向设置;所述质控线C包被有CanineCV重组抗原;所述检测线T包被有CanineCV抗体;远离所述样品垫的所述硝酸纤维素膜一端搭设在吸水纸下。2.根据权利要求1所述的用于检测犬圆环病毒抗原的免疫层析试剂条,其特性在于:所述标记垫上的CanineCV抗体

胶体金复合物喷量为2~4μl/cm,胶体金标记CanineCV抗体的比例为每毫升标记量为5~10μg,CanineCV抗体

胶体金复合物浓缩倍数为20~30倍,即每20~30ml胶体金浓缩至1ml,喷量为2~4μl/cm。3.根据权利要求1所述的用于检测犬圆环病毒抗原的免疫层析试剂条,其特性在于:所述硝酸纤维素膜上的检测线T包被的CanineCV抗体的浓度为0.5~1.0mg/ml,划线量为1.0~2.0μl/cm;所述的质控线C包被的CanineCV抗原的浓度为1.0~2.0mg/ml,划线量为1.0~2.0μl/cm。4.根据权利要求1所述的用于检测犬圆环病毒抗原的免疫层析试剂条,其特性在于:所述胶体金粒径为20

50nm。5.权利要求1

4任一项所述的用于检测犬圆环病毒抗原的免疫层析试剂条的制备方法,其特性在于:包括下列步骤:(1)胶体金溶液的制备;(2)标记垫的制备,包括CanineCV抗体

胶体金复合物的制备,取1ml的胶体金溶液,加入2~10μl的0.1mol/l K2CO3溶液混匀,加入5~10μg CanineCV抗体混匀15min,再加入50~100μl的10%BSA溶液进行封闭10min,置于冷冻离心机内4℃,10000rpm离心30min,弃上清液,沉淀用胶体金复溶液复溶至30~50μl,2~8℃储存备用;(3)包被质控线C、检测线T;(4)样品垫的预处理;(5)切割与组装;得到成品。6.根据权利要求5所述的用于检测犬圆环病毒抗原的免疫层析试剂条的制备方法,其特性在于:所述的胶体金复溶液含有pH8.2的0.02mo...

【专利技术属性】
技术研发人员:昝洁陈翠翠梁焕坤钟树海赖宏锐郭桂铃李来庆宁波
申请(专利权)人:广州优迪生物科技股份有限公司
类型:发明
国别省市:

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