筛选SARS-CoV病毒的抑制剂的方法和试剂盒及其应用技术

本发明专利技术提供一种筛选SARS

【技术实现步骤摘要】
筛选SARS
‑
CoV病毒的抑制剂的方法和试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体地，涉及筛选SARS
‑
CoV病毒的抑制剂的方法和试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]冠状病毒于2019年开始发生传播，至今，由冠状病毒引起的冠状病毒疾病 (COVID
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19)仍然是全球紧急的公共卫生问题，截至2020年12月，全世界至少报告了7600万冠状病毒疾病病例，其中，死亡例达到160万以上。尽管，几种针对冠状病毒的疫苗已经处于临床试验阶段，但在预期的一段时间内，感染冠状病毒以及由此致死的人数都将继续上升，这将对社会健康和经济发展造成灾难性影响。目前，已对多种药物进行了针对COVID
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19的抑制性效果测试，如 Remdesivir.RTM。但是，在这些药物中，很少能够在临床试验中对COVID
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19显示出强大抑制效果。因此，COVID
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19患者的医院护理将在世界范围内变得司空见惯，并且在严重情况下治疗诸如细胞因子风暴和器官衰竭等并发症将需要加大对新疗法功效的研究。
[0003]COVID
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19的病原体是急性呼吸综合症冠状病毒2(SARS
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CoV
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2)，属于冠状病毒科病毒的成员，该病毒会在哺乳动物中引起呼吸系统，肝脏，肠道和神经系统疾病。在2002年之前，冠状病毒仅被称为人类的次要病原体，约占普通感冒的15
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25％。然而，由新型冠状病毒SARS
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CoV引起的2002年SARS严重暴发的出现，促使公众对由冠状病毒引起的疾病保持警惕。迄今为止，存在七种已知的人畜共患病冠状病毒，它们可引起人类疾病，其中冠状病毒MERS
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CoV， SARS
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CoV和SARS
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CoV
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2被确定为严重急性呼吸系统综合症的病因。
[0004]如上所述，COVID
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19由SARS
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CoV
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2病毒引起，感染的关键步骤是病毒进入人宿主细胞时，由病毒颗粒表面上的SARS
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CoV
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2Spike(S)蛋白的受体结合域(RBD)与人体细胞表面上的血管紧张素I转换酶2(ACE2)受体相互作用所致。SARS
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CoV
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2对人体细胞上的受体血管紧张素转换酶2(ACE2)具有足够的亲和力，可将其用作细胞进入的机制。研究表明，SARS
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CoV
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2与原始SARS 病毒株相比对人ACE2具有更高的亲和力。跨膜蛋白酶丝氨酸2(TMPRSS2)引发的初始刺突蛋白引发对于SARS
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CoV
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2的进入至关重要。SARS
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CoV
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2病毒体附着到靶细胞后，该细胞的蛋白酶TMPRSS2切开病毒的刺突蛋白，使S2亚基中的融合肽和宿主受体ACE2暴露。融合后，内体在病毒体周围形成，将其与宿主细胞的其余部分分离。当内体的pH降低或宿主组织半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶将其裂解时，病毒粒子会逸出。然后，病毒体将RNA释放到细胞中，并迫使细胞产生并传播病毒的拷贝，从而感染更多的细胞。
[0005]当前，可以使用的一种针对SARS
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CoV
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2病毒的测试是Barnhizer&Faro的测试(美国专利序列号10/844,442)。该测试是经典的酶联免疫球蛋白夹心测定法，为将源自人ACE2蛋白的多肽片段固定在微量滴定板的表面上，利用细菌表达的SARS
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CoV
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2Spike(S)蛋白受体结合域的片段(S1RBD)与其接触，在去除未结合的S1RBD之后，使用标记的抗S1RBD抗体检测ACE2
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S1RBD复合体。但是，该测试的灵敏度较低，需要微克数量的主要目标才能获得可检测的信号。
[0006]感染的关键步骤是病毒进入人宿主细胞时，这是由病毒颗粒表面上的SARS
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CoV
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2 Spike(S)蛋白的受体结合域(RBD)与人体细胞表面血管紧张素转化酶2(ACE2) 之间的相互作用。鉴定小分子、抗体(例如病毒中和抗体)或其他干扰S1RBD
‑ꢀ
ACE2复合物形成的生物分子可以帮助开发预防或治疗COVID
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19的药物。因此，需要一种灵敏度高的高通量测试方法，在不需要大量靶多肽的情况下，能够有效鉴定可能存在的S1RBD
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ACE2结合抑制剂。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供筛选SARS
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CoV病毒的抑制剂的方法和试剂盒及其应用，以提高对SARS
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CoV病毒具有抑制效果的化合物的检测灵敏度。
[0008]根据本专利技术的一个方面，提供一种筛选SARS
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CoV病毒的抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，准备SARS
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CoV
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2病毒刺突蛋白的刺突受体结合结构域编码的糖基化多肽和血管紧张素转化酶2，糖基化多肽和/或血管紧张素转化酶2被标记底物标记；步骤二，在不含有待测样品的反应体系中，使糖基化多肽与血管紧张素转化酶2复合而形成参照复合物；步骤三，在含有待测样品的反应体系中，使糖基化多肽与血管紧张素转化酶2复合而形成待测复合物；步骤四，分别对参照复合物和待测复合物进行量化特征参数的检测；步骤五，利用步骤四测得的对应量化特征参数的差值表征抑制剂对SARS
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CoV病毒的抑制程度。
[0009]优选地，抑制剂为小分子、抗体或多肽中的至少一种。
[0010]优选地，糖基化多肽包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
[0011]优选地，糖基化多肽的糖基化位点包括N343
‑
糖基化位点。
[0012]优选地，糖基化多肽通过哺乳动物细胞表达获得。
[0013]优选地，糖基化多肽被标记底物标记，标记底物为具有Fc区的免疫球蛋白 G。
[0014]优选地，标记底物为辣根过氧化酶。
[0015]根据本专利技术的另一个方面，提供一种试剂盒，包括：SARS
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CoV
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2病毒刺突蛋白的刺突受体结合结构域编码的糖基化多肽、血管紧张素转化酶2、包含若干个微孔的微量滴定板、洗涤缓冲液、分析稀释剂、标记底物反应液、反应终止液；其中，糖基化多肽和/或血管紧张素转化酶2被标记底物标记。
[0016]优选地，糖基化多肽通过哺乳动物细胞表达获得。
[0017]优选地，糖基化多肽包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种筛选SARS
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CoV病毒的抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，准备SARS
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CoV
‑
2病毒刺突蛋白的刺突受体结合结构域编码的糖基化多肽和血管紧张素转化酶2，所述糖基化多肽和/或所述血管紧张素转化酶2被标记底物标记；步骤二，在不含有待测样品的反应体系中，使所述糖基化多肽与所述血管紧张素转化酶2复合而形成参照复合物；步骤三，在含有待测样品的反应体系中，使所述糖基化多肽与所述血管紧张素转化酶2复合而形成待测复合物；步骤四，分别对所述参照复合物和所述待测复合物进行量化特征参数的检测；步骤五，利用所述步骤四测得的对应所述量化特征参数的差值表征所述抑制剂对SARS
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CoV病毒的抑制程度。2.如权利要求1所述筛选SARS
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CoV病毒的抑制剂的方法，其特征在于：所述抑制剂为小分子、抗体或多肽中的至少一种。3.如权利要求1所述筛选SARS
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CoV病毒的抗体或抑制剂的方法，其特征在于：所述糖基化多肽包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。4.如权利要求3所述筛选SARS
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CoV病毒的抗体或抑制剂的方法，其特征在于：所述糖基化多肽的糖基化位点包括N343
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糖基化位点。5.如权利要求4所述筛选SARS
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CoV病毒的抑制剂的方法，其特征在于：所述糖基化多肽通过哺乳动物细胞表达获得。6.如权利要求2～5任一项所述筛选SARS
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CoV病毒的抑制剂的方法，其特征在于：所述糖基化多肽被标记底物标记，所述标记底物为具有Fc区的免疫球蛋白G。7.如权利要求1所述筛选SARS
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CoV病毒的抑制剂的方法，其特征在于：所述标记底物为辣根过氧化酶。8.一种试剂盒，其特征在于，包括：SARS
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CoV
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2病毒刺突蛋白的刺突受体结合结构域编码的糖基化多肽、血管紧张素转化酶2、包含若干个微孔的微量滴定板、洗涤缓冲液、分析稀释剂、标记底物反应液、反应终止液；其中，所述糖基化多肽和/或所述血管紧张素转化酶2被标记底物标记。9.如权利要求8所述试剂盒，其特征在于：所述糖基化多肽通过哺乳动物细胞表达获得。10.如权利要求9所述试剂盒，其特征在于：所述糖基化多肽包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。11.如权利要求10所述试剂盒，其特征在于：所述糖基化多肽的糖基化位点包括N343
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糖基化位点。12.如权利要求8所述试剂盒，其特征在于：所述微孔的表面包被有所述糖基化多肽，所述血管紧张素转化酶2上缀合有标记底物。13.如权利要求12所述试剂盒，其特征在于：所述标记底...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄若磐，唐浩，罗树红，方建民，
申请(专利权)人：瑞博奥广州生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：