一种用于检测新型冠状病毒（SARS-CoV-2）抗原的试剂卡盒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种用于检测新型冠状病毒SARS

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2)抗原的试剂卡盒及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及新型冠状病毒检测领域，特别是一种用于检测新型冠状病毒 (SARS
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CoV
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2)抗原的试剂卡盒及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]新冠肺炎是由一种具有包膜的单股正链RNA新型冠状病毒(国际病毒分类学委员会命名SARS
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CoV
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2，别名2019
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nCoV)所引发的。电子显微镜下可观察到其外膜上有明显的棒状粒子突起，形态似皇冠，故名冠状病毒。新型冠状病毒是人类冠状病毒中的第七种，属于β冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60～140nm。已知的冠状病毒基因组结构如图1所示，5
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端为开放阅读框(open reading frame，ORF)1a和1b，约占基因组全长2/3，编码聚合酶等非结构蛋白；3
’
端约占基因组1/3区域，编码刺突蛋白(spike,S)、包膜蛋白(envelope， E)、囊膜蛋白(membrane,M)和核衣壳蛋白(nucleocapsid,N)。其中，以S区变异最为显著。新型冠状病毒是继SARS
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CoV和MERS
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CoV后从野生宿主跨越种系感染人类的第三种可引起严重肺炎表现的冠状病毒。人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。
[0003]目前，实时荧光RT
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PCR方法核酸检测是新型冠状病毒感染确诊的重要检测手段，但PCR技术检测耗时费力，对实验室操作人员要求高，很难适应公共卫生事件应急处置需要。虽说核酸检测是新型冠状病毒检测的“金标准”，但核酸检测并不是100％的准确，有些患者会出现假阴性，并且对检测设备或平台要求较高，高灵敏℃的RT
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PCR仪价格昂贵，对实验室的洁净℃和操作人员要求也较高。与核酸检测相比，抗体检测的血液标本更易获取且标本质量有保证、操作简单快捷、无需任何仪器设备、操作者、操作空间不受任何限制，很大程℃上降低了医护人员在标本采集和检测过程中被感染的风险、更易于基层实验室展开筛查工作等。如果说核酸检测病毒的核糖核酸(RNA)，是病毒存在的直接证据，那么抗体检测的就是患者血液中被刺激产生的抗体，是间接证据，对临床有提示作用。当核酸检测阴性时，将IgM和IgG抗体检测增加进去，可以弥补核酸检测容易造成漏诊的缺点。
[0004]另有临床数据显示部分已被感染的患者不能检出病毒核酸，与临床表现不符，这种“假阴性”无法完全避免，假阴性意味着漏检，不仅会导致临床中对疑似患者不能快速确诊，而且会使漏检者成为潜在的病毒传染源。血清学检测方法中最广泛使用的酶联免疫吸附法虽然结果准确，但操作简便性欠佳，需要多次孵育和洗涤，操作繁琐，耗时长，至少1.5h才能检测出结果。解决这种情况一个行之有效的办法，就是补充新型冠状病毒特异抗体检测。
[0005]SARS
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CoV
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2感染人体后，除了对靶器官产生致病过程外，病毒基因组编码的结构蛋白、非结构蛋白还刺激机体免疫系统，产生特异性免疫应答，分泌病原体特异性IgM和IgG抗体至血液循环中，而IgG常发病2周后出现，是病毒感染最可靠的指标，滴度快速上升可提
示近期感染，否则为既往感染。通过检测血清中该抗体，可对临床诊断起到辅助作用。抗体检测对临床实验室的操作要求相对于核酸检测要低，可以快速、大量检测，且可以在基层实验室完成。因此，寻找一种快速、不使用或使用简单易携带的仪器在现场进行检测诊的诊断策略已经成为一种迫切需要。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是对新型冠状病毒可以进行快速的检测，可以实现快速、大规模的批量操作，而且还可避免医务人员采集标本过程中的暴露风险，所抗体检测更安全，为疫情防控提供技术支撑。
[0007]为了实现上述目的：本专利技术提供如下技术方案：
[0008]一种用于检测新型冠状病毒SARS
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CoV
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2抗原的试剂卡盒，包括试剂卡盒本体、设置在试剂卡盒本体内部的检测条、稀释液及使用说明书。
[0009]进一步的，所述试剂卡盒本体包括下盒体，所述下盒体的上表面固定连接有定位台，所述下盒体的上表面固定连接有凸台，所述凸台的上表面固定连接有检测条，所述下盒体上表面的两侧均固定连接有定位柱，所述定位柱的内壁固定连接有定位杆，所述定位杆的上表面固定连接有上盒体，所述上盒体上表面的一侧开设有凹槽，所述上盒体上表面的中部开设有观察窗口，所述上盒体上表面的另一侧开设有透气孔，所述上盒体与下盒体的正面和背面均固定连接有防滑垫。
[0010]进一步的，所述检测条包括PVC底板，所述PVC底板上由前到后依次设置有样品垫、胶体金垫、包被垫和吸水垫，所述包被垫为硝酸纤维素膜，在包被垫上设置有两条测试线，分别是G线15和M线20和一条质控线C线的硝酸纤维素膜，G 线15固定有抗人IgG单抗，用于检测新型冠状病毒IgG抗体，M线20固定有抗人IgM单抗，用于检测新型冠状病毒IgM抗体；C线固定有质控抗体。
[0011]进一步的，一种用于检测新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2)抗原的试剂卡盒的制
[0012]备方法，包括以下步骤：
[0013]S1，辅料，原料，试剂的准备：按标准配方的内容领取所要配制的液体所需的物料，准确称取各组分物料置于适当容器中，加适量工艺用水溶解后混合均匀，测定液体的PH值应与所配制液体要求一致，用工艺用水定容至终体积后送入半成品库存放；
[0014]S11)所有配制试剂的容器均按以上要求酸处理洗净，配制试剂用去离子水；
[0015]S1，胶体金溶液的制备，包括：
[0016]S21)氯化金HauCl4水溶液的配制：将lg的氯化金一次溶解于去离子水中配成1％的水溶液；
[0017]S22)煮金在去离子水加入到反应瓶中，用移液器将氯金酸溶液于所述去离子水中，搅拌，加热至沸腾，再加入1％柠檬酸三钠溶液，溶液由灰色变黑色最后变为红色，再继续加热搅拌10min，关掉加热旋钮，适当速度搅拌至室温，4℃保存，获得胶体金溶液；
[0018]S22)试剂必须保证严格的灭菌或过滤，除去可能混有的杂质；
[0019]S23)配置胶体金溶液的为PH7.0
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7.5，否则缺乏重复性；
[0020]S24)氯金酸极易吸潮，对金属有强烈的腐蚀性，不能使用金属药匙，避免接触天平秤盘；
[0021]S25)金颗粒容易吸附在电极使之堵塞，不能使用PH电极测定金溶液的PH值；
[0022]S3，检测条核心部件的准备，具体操作步骤如下：
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测新型冠状病毒SARS
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CoV
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2抗原的试剂卡盒，其特征在于，包括试剂卡盒本体、设置在试剂卡盒本体内部的检测条(9)、稀释液及使用说明书。2.根据权利要求1所述一种用于检测新型冠状病毒SARS
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CoV
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2抗原的试剂卡盒，其特征在于：所述试剂卡盒本体包括下盒体(6)，所述下盒体(6)的上表面固定连接有定位台(8)，所述下盒体(6)的上表面固定连接有凸台(10)，所述凸台(10)的上表面固定连接有检测条(9)，所述下盒体(6)上表面的两侧均固定连接有定位柱(7)，所述定位柱(7)的内壁固定连接有定位杆(19)，所述定位杆(19)的上表面固定连接有上盒体(1)，所述上盒体(1)上表面的一侧开设有凹槽(2)，所述上盒体(1)上表面的中部开设有观察窗口(3)，所述上盒体(1)上表面的另一侧开设有透气孔(4)，所述上盒体(1)与下盒体(6)的正面和背面均固定连接有防滑垫(5)。3.根据权利要求1所述一种用于检测新型冠状病毒SARS
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CoV
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2抗原的试剂卡盒，其特征在于所述检测条(9)包括PVC底板(11)，所述PVC底板(11)上由前到后依次设置有样品垫(12)、胶体金垫(13)、包被垫(14)和吸水垫(18)，所述包被垫(14)为硝酸纤维素膜，在包被垫(14)上设置有两条测试线，分别是G线(15)和M线(20)和一条质控线C线的硝酸纤维素膜，G线(15)固定有抗人IgG单抗，用于检测新型冠状病毒IgG抗体，M线(20)固定有抗人IgM单抗，用于检测新型冠状病毒IgM抗体；C线固定有质控抗体。4.一种用于检测新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2)抗原的试剂卡盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，胶体金溶液的制备，包括：S11)氯化金HauCl4水溶液的配制：将l g的氯化金一次溶解于去离子水中配成1％的水溶液；S12)煮金取200mL去离子水加入到500mL三角瓶中，置于磁力搅拌器上，打开搅拌旋钮至适当速度，用移液器吸取2mL 1％氯金酸溶液于所述200mL去离子水中，搅拌1min，加热至沸腾，1％柠檬酸三钠溶液3.6mL，溶液在2min内由灰色变黑色最后变为红色，再继续加热搅拌10min，关掉加热旋钮，适当速度搅拌至室温，定容至200mL，4℃保存，获得胶体金溶液；S13)试剂必须保证严格的灭菌或过滤，除去可能混有的杂质；S14)配置胶体金溶液的为PH7.0
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7.5，否则缺乏重复性；S15)氯金酸极易吸潮，对金属有强烈的腐蚀性，不能使用金属药匙，避免接触天平秤盘；S16)金颗粒容易吸附在电极使之堵塞，不能使用PH电极测定金溶液的PH值；S2，检测条(9)核心部件的准备，具体操作步骤如下：S21.制作样品垫；S22.制作载有抗体的玻璃纤维素膜条或聚酯膜条，这是胶体金垫；S23.制作合适观察窗口(3)孔径的硝酸纤维素膜条，所述硝酸纤维素膜条喷涂有显示阳性结果的捕捉分析物的配体线，和阴性对照组线，这是测试线(9)所在的膜条，所述捕捉分析物是抗人IgG和IgM抗体，阴性对照组线是COIVD
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19的多克隆抗体；S24.制作吸水垫，S25.将S21
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S24中准备的四部分衔接固定在不干扰免疫反应和流速的簿塑料背板上；S3，胶体金标记物的制备：在电磁搅拌器下降1/10体积的时候，将抗原加于胶体金溶
液，反应一定时间后加入BSA并调整至pH8.0，放置至室温继续反应，封闭多余的游离胶体金，稳定胶体金标记物；S4，NC膜处理：NC膜上预先包被上测试线(15)和质控线(16)，测试线(15)能够与胶体金标记物发生免疫反应相结合，使胶体金在测试线(15)发生聚集，根据测试线(15)的显色状况判读结果；S5，将胶体金标记物喷涂在玻璃纤维素上，在干燥间或烘箱中37℃将其烘干；将样品垫处理液浸涂在玻璃纤维素膜上，在干燥间或烘箱中37℃将其烘干，得到胶体金垫；S6，印模制备：将硝酸纤维素膜NC膜贴在PVC底板上，将印模机的C、T线调整搭配合适的距离，然后进行印模，最后将印好的膜放在干燥间或烘箱中37℃将其烘干；S7，组板：将吸水垫和制备好的金垫、样品垫裁切至合适的宽度，与印好C、T线的硝酸纤维素膜贴在PVC板的位置；S8，切条：根据检测卡卡槽的宽度，将组装好的大板裁切成一定宽度的检测条(9)，裁切宽度均一，无压痕，无划伤；S9，包装：将裁切好的检测条压入试剂卡盒本体内，得到一种用于检测新型冠状病毒(SARS
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2)抗原的试剂卡盒。5.根据权利要求4的一种用于检测新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2)抗原的试剂卡盒中的制备方法，所述检测条(9)的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：A1：金溶液的制备：A11：取200mL去离子水于洄流圆底烧瓶中，加入1mL 1％HAuCL4溶液，混匀；A12：洄流圆底烧瓶置于电热套式恒温器中，加入干净搅拌子，低速搅拌并加热沸腾；A13：迅速一次性加入1mL 1％柠檬酸三钠溶液，继续煮沸；A14：观察溶液颜色变化，依次是由浅黄、黑色、紫色、紫红色，当完全变为紫红色时，继续洄流10min；A15：停止加热，冷却至室温，得到金溶液；A2：金溶液检测：采用分光光度计，取金溶液，将其设定为500
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550nm扫描，用ddH2O调零，分光光度计在532nm
±
2nm(40nm)522nm
±
2nm(30nm)附近有最高吸收峰；A3：金溶液pH调节：A31：配制1％K2CO3溶液；A32：用1％K2CO3调节金溶液pH至7.4
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9.0，得到待用金溶液；A4：抗体的金标记：A41：抗体的前处理和保存，抗体即为步骤中的蛋白：A411：腹水的纯化：利用饱和硫酸铵沉淀法或辛酸沉淀法获得抗体，具体如下：将小鼠腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物；滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液pH4.0稀释后，用1M NaOH调pH至4.5；逐滴加入辛酸，终浓度为25μl/mL稀释腹水，室温搅拌30min，4℃静置2h；4、12000r/min，4℃，30min，收集上清；上清液用滤纸过滤1次，加入1/10体积的10
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PBS，冰浴至4℃；根据每mL上述混合液加0.277g固体硫酸铵，冰浴条件下边搅拌边缓慢加入硫酸铵，多次慢慢加入，并搅拌，以免造成局部浓度过高；硫酸铵全加入后，再搅拌10
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30min，使溶液完全平衡，然后就可以进行离心，采取4℃搅拌30min后，继续静置至少1h，再13000r/min，4℃离心30mi...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈真诚，聂晓宁，髙忠华，
申请(专利权)人：四川高润德生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：