一种犬腺病毒Ⅱ型检测试剂盒和方法技术

本发明专利技术公开了一种犬腺病毒Ⅱ型检测试剂盒，包括抗犬腺病毒Ⅱ型的单克隆抗体E1和E2、Tris‑HCl缓冲液、包被板条、层析柱、铕标记试剂、分析缓冲液和标准品。本发明专利技术采用时间分辨荧光微球作为标记物，提高了对犬腺病毒的检测灵敏度和准确度；本发明专利技术的试剂盒可以动态观察疗效和病情监测：定量检测犬腺病毒抗原浓度变化，可对CAV的病程、治疗、预后起一个动态监测的作用；本发明专利技术的试剂盒检测的批间和批内差异小，性能稳定。

【技术实现步骤摘要】
一种犬腺病毒Ⅱ型检测试剂盒和方法
本专利技术涉及病毒检测
，尤其是一种犬腺病毒Ⅱ型检测试剂盒和方法。
技术介绍
犬腺病毒(CAV)是哺乳动物腺病毒属中致病性最强的一种病毒，有两个血清型。Ⅰ型可引起犬传染性肝炎和狐狸脑炎；Ⅱ型主要引起犬的传染性喉气管炎和肠炎，多可见于4月龄以下的幼犬，潜伏期为5-6天，以持续性高热(体温在39.5℃左右)、咳嗽、浆液性或黏液性鼻涕、扁桃体炎、喉气管炎和肺炎为特征。CAV-Ⅱ型不仅流行于我国和世界各地家养的犬、狐中，而且广泛地流行于野生的狐、熊、郊狼和浣熊等动物中。该病一年四季均可发生，各种性别、年龄和品种的犬、狐均易感染，但其中以离乳至一岁的动物，发病率和死亡率最高。病程较犬瘟热短，大约在2周内恢复或死亡，有时在数日内死亡。如与犬瘟热混合感染，则死亡率更高。患病犬及带毒犬是本病传染来源，本病主要通过消化道感染，也可通过胎盘传染。市场上现有的检测犬腺病毒Ⅱ型的试剂盒有胶体金法。传统的胶体金法只能定性分析阳性与阴性问题，而无法做到精确定量，且检测灵敏度低。因此，建立一种可以定量检测CAV-Ⅱ型的鉴别与诊断方法具有很高的实用性和现实意义，以便尽快采取有效的治疗和防控措施，减少这些疾病对养犬业造成的危害。
技术实现思路
基于上述问题，本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种犬腺病毒Ⅱ型检测试剂盒，采用本专利技术的试剂盒和检测方法能定量检测犬腺病毒抗原浓度变化，可对CAV的病程、治疗、预后起一个动态监测的作用。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案包括：在第一个方面，本专利技术提供了一种犬腺病毒Ⅱ型检测试剂盒，包括抗犬腺病毒Ⅱ型的单克隆抗体E1和E2、Tris-HCl缓冲液、包被板条、层析柱、铕标记试剂、分析缓冲液和标准品。需要说明的是，单克隆抗体E1和E2均靶向抗犬腺病毒Ⅱ型的核衣壳蛋白，但是，本专利技术的试剂盒中采用的单克隆抗体包括但不限于E1和E2，还可以是其它能靶向结合犬腺病毒Ⅱ型核衣壳蛋白的单克隆抗体，只要该单克隆抗体具有足够的特异性和亲和力即可。其中，单克隆抗体E1和E2的亲和力可以相同，也可以有差异，但是对核衣壳蛋白的亲和力差异不得超过10％，以免导致检测误差。优选地，所述铕标记试剂为Eu3+标记试剂盒。优选地，所述层析柱为SephadexG-50层析柱。优选地，所述分析缓冲液为Tris-HCl、NaCl、BSA、Tween-20和NaN3的混合溶液；更优选地，所述分析缓冲液为50mmol/L的Tris-HCl，每升分析缓冲液中还含有0.09％(W/V)的NaCl，0.02％(W/V)BSA，0.05％(W/V)Tween-20以及0.05％(W/V)的NaN3；优选地，所述分析缓冲液的pH值为7.8。优选地，所述标准品的制备方法为：用50mmol/L的Tris-HCl(pH7.8)的标准品缓冲液将犬腺病毒抗原准确稀释成0，5，10，20，50，100ng/mL6个浓度，即得，其中，所述标准品缓冲液含有0.2％(W/V)BSA和0.1％(W/V)NaN3。在第二个方面，本专利技术提供了一种犬腺病毒Ⅱ型的检测方法，包括如下步骤：(1)向包被有抗犬腺病毒抗体E1的酶联板上加入犬腺病毒抗原标准品和待测样本；(2)向步骤(1)所得酶联板加入分析缓冲液，震荡温育，洗涤液洗涤，再加入以分析缓冲液稀释的Eu3+-E2标记抗体，震荡温育，洗涤液洗涤；(3)最后加入增强液震荡后，在时间分辨荧光检测仪上进行检测。优选地，所述检测方法包括如下步骤：(1)向包被有抗犬腺病毒抗体E1的酶联板上加入25μL犬腺病毒抗原标准品和待测样本；(2)向步骤(1)所得酶联板加入200μL分析缓冲液，震荡温育1h，洗涤液洗涤4次，再加入以分析缓冲液1：50～100倍稀释的Eu3+-E2标记抗体200μL/孔，震荡温育1h，洗涤液洗涤6次；(3)最后加入增强液200μL/孔，震荡5min后，在时间分辨荧光检测仪上进行检测。综上所述，本专利技术的有益效果为：本专利技术采用时间分辨荧光微球作为标记物，提高了对犬腺病毒的检测灵敏度和准确度；本专利技术的试剂盒可以动态观察疗效和病情监测：定量检测犬腺病毒抗原浓度变化，可对CAV的病程、治疗、预后起一个动态监测的作用；本专利技术的试剂盒检测的批间和批内差异小，性能稳定；其中的单克隆抗体与犬瘟热、犬细小、犬流感、狂犬等抗体没有明显交叉反应。附图说明图1为标准曲线。具体实施方式本专利技术采用时间分辨荧光微球作为标记物，采用双抗体夹心法检测犬腺病毒抗原，可以实现定量检测，提高了检测的灵敏度和准确性。在本专利技术中，采用时间分辨荧光微球作为标记物，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度和抗干扰能力；同时，本专利技术的试剂盒操作方便，检测速度快，具有较高的稳定性和重显性。为更好的说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明。如无特别说明，本申请中试剂的浓度均为质量浓度；本申请中试剂均可从市场或其它公开渠道获得；本申请中的实验方法均为常规方法。实施例1本专利技术的犬腺病毒Ⅱ型检测试剂盒的一种实施例，包括抗犬腺病毒Ⅱ型的单克隆抗体E1和E2、Tris-HCl缓冲液、包被板条、SephadexG-50层析柱、Eu3+标记试剂盒、分析缓冲液和标准品。其中，各成分分别采用如下方法制备：1、抗犬腺病毒抗体的制备用犬腺病毒Ⅱ型(CAV-Ⅱ)进行BALB/c小鼠免疫。通过细胞融合技术进行单克隆抗体制备，筛选特异性强、亲和力高的抗犬腺病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体E1、E2。2、包被板制备将纯化的抗CAV-Ⅱ单克隆抗体E1用Tris-HCl缓冲液稀释，稀释成3μg/mL，100μL/孔加入包被板条孔内，经吸附、洗涤、封闭、干燥后获得抗CAV-Ⅱ单克隆抗体包被板条。3、Eu3+标记抗体的制备将待标记抗体E2加入Millipore公司的带有滤膜的离心管中离心，用标记缓冲液重复洗涤数次。再将200μL标记抗体E2和铕标记试剂充分混匀，室温震荡过夜。标记完成后用SephadexG-50层析柱分离纯化，洗脱液洗脱，同时收集流岀液，逐管测量吸光度，合并峰管，测定蛋白含量，根据Eu3+标记试剂盒说明书所提供的公式测定标记率和蛋白回收率。4、分析缓冲液分析缓冲液为：50mmol/LpH7.8Tris-HCl，每升含0.09％NaCl，0.02％BSA，0.05％Tween-20，0.05％NaN3。5、标准品制备用含0.2％BSA，0.1％NaN3，50mmol/L的Tris-HCl(pH7.8)的标准品缓冲液将犬腺病毒抗原准确稀释成0，5，10，20，50，100ng/mL6个浓度。实施例2本专利技术的犬腺病毒Ⅱ型的检测方法的一种实施例，包括如下步骤：向包被有抗犬腺病毒抗体E1的酶联板上加入25μL犬腺病毒抗原标准品和待测样本，再加入200μL分析缓冲液，震荡温育1h，洗涤液洗涤4次，再加入以分析缓冲液1：50～100倍稀释的Eu3+-E2标记抗体200μL/孔，震荡温育1h，洗涤液洗涤6次，最后加入增强液200μL/孔震荡5min后，在时间分辨荧光检测仪上进行检测。犬腺病毒时间分辨标准曲线见附图1，标准曲线的相关系数为R2＝0.9920，表明线性相关性良好。该方法的检测灵敏度为0.56ng/本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种犬腺病毒Ⅱ型检测试剂盒，其特征在于，包括抗犬腺病毒Ⅱ型的单克隆抗体E1和E2、Tris‑HCl缓冲液、包被板条、层析柱、铕标记试剂、分析缓冲液和标准品。

【技术特征摘要】
1.一种犬腺病毒Ⅱ型检测试剂盒，其特征在于，包括抗犬腺病毒Ⅱ型的单克隆抗体E1和E2、Tris-HCl缓冲液、包被板条、层析柱、铕标记试剂、分析缓冲液和标准品。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述铕标记试剂为Eu3+标记试剂盒。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述层析柱为SephadexG-50层析柱。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述分析缓冲液为Tris-HCl、NaCl、BSA、Tween-20和NaN3的混合溶液。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述分析缓冲液为50mmol/L的Tris-HCl，每升分析缓冲液中还含有0.09％(W/V)的NaCl，0.02％(W/V)BSA，0.05％(W/V)Tween-20以及0.05％(W/V)的NaN3。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述分析缓冲液的pH值为7.8。7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述标准品的制备方法为：用50mmol/L的Tris-HCl(pH7.8)的标准品缓...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁焕坤，陈翠翠，李来庆，郭晓晓，刘细潘，钟树海，郭桂铃，赖宏锐，宁波，何莹，
申请(专利权)人：广州优迪生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44