一种用于区分梅毒早晚期感染的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于区分梅毒早晚期感染的方法，利用分子生物学基因克隆表达技术，获得梅毒TP0136重组蛋白，以纯化的梅毒TP0136重组蛋白作为抗原，建立检测TP0136抗体的ELISA方法并组装成试剂盒，基于梅毒感染者TP0136抗体水平来区分早晚期感染，有利于指导临床合理用药，避免过度治疗，为梅毒的诊治提供一种快速、简便的检测方法。通过检测TP0136抗体水平区分梅毒感染时期，弥补了梅毒分期诊断检测方法的空白；具有检测通量大、结果确切、灵敏度高、操作简单的特点，易于基层推广。

【技术实现步骤摘要】
一种用于区分梅毒早晚期感染的方法
本专利技术涉及梅毒抗体检测领域，具体涉及一种用于区分梅毒早晚期感染的方法。
技术介绍
梅毒是由梅毒螺旋体苍白球亚种(Treponemapallidumsubsp.pallidum)感染所致的一种性传播疾病。流行病学数据显示，全球共有2500万人感染梅毒，每年梅毒新发病例超过1100万。此外，证据表明梅毒的先天传播是发展中国家导致胎儿和围产儿死亡的首要原因；而梅毒感染会增加人免疫缺陷病毒传播和获得，因此梅毒是重要的全球性健康问题。根据感染梅毒的时间分为早期梅毒(2年内)和晚期梅毒(2年以上)。根据梅毒的临床表现可分为一期梅毒(如感染部位的溃疡或硬下疳)、二期梅毒(包括二期梅毒疹、皮肤粘膜病变、淋巴结肿大等)、三期梅毒(心脏梅毒、树胶肿、脊髓痨、麻痹性痴呆等)。但由于临床超过70％的梅毒感染者缺乏临床表现，被称为潜伏感染。其中感染两年以内的潜伏梅毒称为早期潜伏梅毒，感染两年以上的称为晚期潜伏梅毒。不同病期梅毒治疗方案不同，但由于潜伏梅毒缺乏临床表现，患者往往不知道具体感染时间，因此对梅毒进行正确分期有利于帮助临床指导治疗和后续的随访。常用的梅毒诊断检测方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于区分梅毒早晚期感染的方法，采用含有梅毒螺旋体TP0136抗原蛋白，包括如下步骤：Step.1梅毒螺旋体菌株的传代和分离：梅毒螺旋体Nichols株通过睾丸内接种法，在新西兰白兔睾丸中繁殖和提取；Step.2从兔睾丸组织中提取梅毒螺旋体DNA：从感染兔睾丸中提取的螺旋体经低速离心，使用微量离心机离心沉淀梅毒螺旋体。重新悬浮梅毒螺旋体于1X细胞溶解缓冲液中，重新悬浮梅毒螺旋体冷冻于‑20℃或根据需要应用QIAamp DNA Mini试剂盒(QIAGEN)提取DNA，按说明书操作提取DNA，提取后DNA储存于‑20℃；。Step.3TP0136序列分析和引物设计：从Genbank的蛋白质...

【技术特征摘要】
1.一种用于区分梅毒早晚期感染的方法，采用含有梅毒螺旋体TP0136抗原蛋白，包括如下步骤：Step.1梅毒螺旋体菌株的传代和分离：梅毒螺旋体Nichols株通过睾丸内接种法，在新西兰白兔睾丸中繁殖和提取；Step.2从兔睾丸组织中提取梅毒螺旋体DNA：从感染兔睾丸中提取的螺旋体经低速离心，使用微量离心机离心沉淀梅毒螺旋体。重新悬浮梅毒螺旋体于1X细胞溶解缓冲液中，重新悬浮梅毒螺旋体冷冻于-20℃或根据需要应用QIAampDNAMini试剂盒(QIAGEN)提取DNA，按说明书操作提取DNA，提取后DNA储存于-20℃；。Step.3TP0136序列分析和引物设计：从Genbank的蛋白质和DNA资料库中搜索TP0136氨基酸和核酸序列，应用BioEdit7.1软件对密螺旋体属的5个梅毒苍白密螺旋体(Nichols、DAl-1、Chicago、MexicoA和SS14)、3个雅司苍白密螺旋体(SamoaD、CDC2和Gauthier)和1个未分类的类人猿密螺旋体(Fribourg-Blanc)进行多重序列比对；Step.4应用引物设计软件对GenBank查询到Nichols标准株TP0136基因序列进行引物设计，用SignalP4.1Server软件预测TP0136信号肽，TP0136开放阅读框架引物不含信号肽；Step.4梅毒螺旋体TP0136DNA扩增：常规PCR扩增梅毒螺旋体Nichols株TP0136DNA。上游引物(Fp)为:ATGACGTGCGATTTCACTGG(SEQIDNo:2)；下游引物(Rp)为：CTCGCGGTTCCAGGAGCACG(SEQIDNo:3)。加入PCR扩增反应试剂在95℃变性10min；95℃变性1min、60℃变性2min、72℃变性1min，重复以上变性共45个循环；最后一次72℃延伸10min，扩增PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定；Step.5重组表达质粒的构建：PCR产物克隆入pPEX5-CT载体(Invitrogen)。载体导入TOP10感受态大肠杆菌(Invitrogen)中：将反应管孵育在22℃下5分钟；随后将反应管置于冰上反应，并将TOP10感受态大肠杆菌也置于冰上，TOP10感受态大肠杆菌储存温度为-80℃；制备水浴锅至42℃；将S.O.C.试剂置于室温复温；将含有100μg/mL氨苄青霉素的LB板置于37℃温箱30分钟；冰上解冻感受态细胞；添加2μl载体反应液到TOP10感受态大肠杆菌，轻轻混匀；在冰上孵育5到30分钟；在42℃热休克感染态细胞30秒，不能晃动；立即将反应管转移到冰上3分钟；添加250μl室温复温的S.O.C.试剂；拧紧试管帽，37℃200转水平摇晃1小时；取100μl，均匀涂抹于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB板，37℃孵育过夜；高效克隆反应会产生数百个菌落，挑选10个菌落，用常规PCR法验证转化子；取转化正确的转化子摇菌过夜，质粒小提试剂盒(Qiagen)提取质粒；Step.6重组蛋白的表达和纯化：经测序验证正确的pPEX5-CT-TP0136表达载体转化到感受态大肠杆菌Rosetta细胞(MerckKGaA，德国)，在第一天将转化子置于LB+1％葡萄糖琼脂板上，处理以抗生素，抗生素含氨苄青霉素100μg/mL，放置在37℃的培养箱中过夜；第2天上午，从新鲜琼脂平板转移菌落于2mLZYP-0.8G或LB+1％葡萄糖，加上抗生素，抗生素含氨苄青霉素100μg/mL，置于18×150毫米的卡扣帽管中，以300RPM在37℃下摇菌3-4小时，直到培养变混浊，准备5个2升的烧瓶，每个烧瓶加入400mLZYMP-5052培养基和抗生素，抗生素含氨苄青霉素100μg/mL；在第2天凌晨，转移200μl接种物培养到含有400mLZYP-5052+抗生素的2升烧瓶中，以220RPM在室温下摇菌72小时，在第5天上午，将含有该培养物的烧瓶置于冰桶中冷却，待培养物冷却后，从每个烧瓶中取1.0mL培养物，并将其放置在标记了的1.5mL离心管中，用500μlSDS-PAGE样品缓冲液重新悬浮培养物，煮沸样品10分钟后，用台式离心机13000转离心5分钟，将清澈湛蓝的上清液装于新的1.5mL离心管中，剩余的沉淀细菌重新离心2分钟，去上清液，用免疫印记法验证含6xHis标签的蛋白：表达的蛋白通过SDS-PAGE分离并转移到硝化纤维素膜后，用抗6xHis抗体(Sigma)检测证实TP0136为不溶性蛋白质；将烧瓶中的培养物分装于0.3升的离心瓶中，在4℃下6000×g离心10分钟沉淀细菌，倒出上清液，沉淀存于-80℃低温；每1升沉淀物用30mL冷的1X结合缓冲液进行重悬，如果蛋白是不可溶的，加入0.1％NP-40到结合缓冲液；超声波处理器GEX130(Cole-Parmer)对重悬沉淀进行超声处理5分钟，尽量避免形成泡沫，超声处理后，在13000rpm下离心15分钟；去上清，每1升沉淀用30mL冷的1×结合缓冲液(不含NP-40)进行重悬，再次超声处理和13000rpm下离心15分钟，去上清，每1升沉淀用80mL1X结合缓冲液+6M盐酸胍进行重悬，在4℃磁力搅拌器上孵育过夜；用SorvallRC-5B冷...

【专利技术属性】
技术研发人员：柯吴坚，刘雅慧，杨斌，
申请(专利权)人：柯吴坚，
类型：发明
国别省市：广东,44