一种提高乙酰丙酮合成效率的乙酰丙酮裂解酶突变体、核苷酸、表达载体、重组菌及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种提高乙酰丙酮合成效率的乙酰丙酮裂解酶突变体、核苷酸、表达载体、重组菌及应用，属于基因工程技术领域。本发明专利技术通过定点突变的方法，将乙酰丙酮裂解酶第15位的赖氨酸变为谷氨酰胺，同时将乙酰丙酮裂解酶第60位的丙氨酸变为天冬氨酸，将乙酰丙酮裂解酶突变体用于乙酰丙酮的合成后，提高了乙酰丙酮的产量，达到112.9mg/L，本发明专利技术对乙酰丙酮裂解酶的工程改造和乙酰丙酮的生物合成提供了良好范例。好范例。

【技术实现步骤摘要】
一种提高乙酰丙酮合成效率的乙酰丙酮裂解酶突变体、核苷酸、表达载体、重组菌及应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种提高乙酰丙酮合成效率的乙酰丙酮裂解酶 突变体、核苷酸、表达载体、重组菌及应用。

技术介绍

[0002]乙酰丙酮，又名2,4-戊二酮(CAS NO.123-54-6)。其广泛应用于燃料添加剂、染料中间 体、树脂改性剂、金属提炼等，国内90％的乙酰丙酮用于医药和兽药的生产。近年来，乙酰 丙酮下游医药出口形势越来越好，需求得到快速增长。当前乙酰丙酮的生产，主要是以化学 合成法为主。但化学合成乙酰丙酮步骤繁琐，存在能耗高(500-600℃)、污染重等瓶颈问题， 不符合当今低碳经济的需求。
[0003]生物法合成效率高、能耗低、能够避免大量污染物的生成，和化学法相比优势明显。但 乙酰丙酮的生物合成方法尚未引起广泛关注。乙酰丙酮可以被约翰逊不动杆菌Acinetobacterjohnsonii降解利用，但是可逆反应是否能实现，还没有相关研究。在中国专利 CN201810865467.0中，通过对来自Acinetobacter johnsonii的乙酰丙酮裂解酶基因核苷酸序列 进行优化，在大肠杆菌体内过表达后，首次实现了乙酰丙酮的生物合成。但是，乙酰丙酮的 合成效率还比较低，产量只有53mg/L。

技术实现思路

[0004]为了提高生物法合成乙酰丙酮的合成效率，本专利技术提供了一种提高乙酰丙酮合成效率的 乙酰丙酮裂解酶突变体、核苷酸、表达载体、重组菌及应用。具体技术方案如下：
[0005]一种提高乙酰丙酮合成效率的乙酰丙酮裂解酶突变体，所述乙酰丙酮裂解酶突变体的氨 基酸序列如SEQ ID NO.1所示，是将SEQ ID NO.3所示乙酰丙酮裂解酶第15位的赖氨酸变 为谷氨酰胺，同时将乙酰丙酮裂解酶第60位的丙氨酸变为天冬氨酸获得的。
[0006]本专利技术还提供了编码上述乙酰丙酮裂解酶突变体的核苷酸，所述核苷酸序列为下述的一 种：
[0007]1).SEQ ID No.2所示核苷酸序列；
[0008]2).与SEQ ID No.2所示核苷酸序列互补的核苷酸序列；
[0009]3).与1)或2)所述核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与1)或2)的核苷 酸序列不同的核苷酸序列。
[0010]本专利技术还提供了含有上述核苷酸序列的重组载体。
[0011]在本专利技术的一个实施例中，所述重组载体的出发质粒为pETDuet-1。
[0012]本专利技术还提供了含有上述核苷酸序列的重组菌。
[0013]在本专利技术的一个实施例中，所述重组菌的出发菌株为大肠杆菌。
[0014]本专利技术还提供了上述乙酰丙酮裂解酶突变体在生产乙酰丙酮中的应用。
[0015]本专利技术还提供了上述编码乙酰丙酮裂解酶突变体的核苷酸在生产乙酰丙酮中的
应用。
[0016]本专利技术还提供了上述重组载体在生产乙酰丙酮中的应用。
[0017]本专利技术还提供了上述重组菌在生产乙酰丙酮中的应用。
[0018]在本专利技术的一个实施例中，生产乙酰丙酮的方法如下：将重组菌菌株接种到发酵培养基 中(内含100μg
·
mL-1氨苄青霉素)，30～37℃，振荡培养至OD
600
为0.5-0.8，然后加入IPTG 进行诱导24-72h，制备获得生产乙酰丙酮。
[0019]优选地，上述生产乙酰丙酮的方法如下将重组菌菌株接种到发酵培养基中(内含 100μg
·
mL-1氨苄青霉素)，30℃，振荡培养至OD
600
为0.6，然后加入IPTG进行诱导24h， 制备获得生产乙酰丙酮。
[0020]有益效果
[0021]本专利技术通过定点突变的方式，将乙酰丙酮裂解酶第15位的赖氨酸变为谷氨酰胺，将乙酰 丙酮裂解酶第60位的丙氨酸变为天冬氨酸，将改造后的酶在E.coli BL21(DE3)内表达后，乙 酰丙酮产量提高了71.7％，达到112.9mg/L。
具体实施方式
[0022]定义和缩写
[0023]本专利技术中使用下列的缩写或简称：
[0024]乙酰丙酮裂解酶基因：dke1
[0025]大肠杆菌(Escherichia coli)：E.coli
[0026]Dke1
K15Q
右上角“K15Q”代表野生型乙酰丙酮裂解酶基因dke1编码的氨基酸中第15位的 赖氨酸变为谷氨酰胺。
[0027]Dke1
K15Q/A60D
右上角“K15Q/A60D”代表野生型乙酰丙酮裂解酶基因dke1编码的氨基酸中 第15位的赖氨酸变为谷氨酰胺以及第60位的丙氨酸变为天冬氨酸。
[0028]下面通过实例来进一步阐明本专利技术。但本专利技术并不限于以下实施例。
[0029]下述实施例中所使用的实验方法若无特殊说明，均为常规方法。
[0030]下述实施例中所使用的材料、试剂等若无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0031]所用酶试剂购自MBI Fermentas公司，提取质粒所用的试剂盒和回收DNA片段所用的 试剂盒购自美国OMEGA公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别 说明均用去离子水配制。
[0032]培养基配方：
[0033]LB液体培养基：5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，pH 7。
[0034]LB固体培养基：5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，15g/L琼脂，pH 7。
[0035]摇瓶发酵培养基：20g/L葡萄糖，5g/L酵母粉，10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，pH 7。
[0036]在实际培养过程中，可向上述培养基中添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如 100μg
·
mL-1氨苄青霉素。
[0037]实施例1制备提高乙酰丙酮合成效率的乙酰丙酮裂解酶突变体编码基因的表达载体。
[0038]对来源于约翰逊不动杆菌的乙酰丙酮裂解酶基因序列进行密码子优化，并通过苏州金唯 智公司合成该基因(SEQ ID NO.4)。以合成的基因为模板，利用定点突变，设计引
物。
[0039]通过PCR扩增分别获得dke1基因上游片段(引物为F： CGGGATCCGATGGACTACTGCAACA和R：TTGTTGTCAGAGATTTGAACGTATTCTT)和 下游片段(引物为F：AAGAATACGTTCAAATCTCTGACAAAA和R： CGGAATTCTTAAGCAGCTTCGTTTTTGGTA)，再利用回收试剂盒回收目的片段。以获得的 上下游片段为底物，通过搭桥PCR(引物为F：CGGGATCCGATGGACTACTGCAACA和R： CGGAATTCTTAAGCAGCTTCGTTTTTGGTA)获得第15位的赖氨酸变为谷氨酰胺的乙酰丙 酮裂解酶突变基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高乙酰丙酮合成效率的乙酰丙酮裂解酶突变体，其特征在于，所述乙酰丙酮裂解酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，是将SEQ ID NO.3所示乙酰丙酮裂解酶第15位的赖氨酸变为谷氨酰胺，同时将乙酰丙酮裂解酶第60位的丙氨酸变为天冬氨酸获得的。2.一种编码权利要求1所述的乙酰丙酮裂解酶突变体的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列为下述的一种：1).SEQ ID No.2所示核苷酸序列；2).与SEQ ID No.2所示核苷酸序列互补的核苷酸序列；3).与1)或2)所述核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与1)或2...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯新军，周怡斐，咸漠，赵广，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：