具有越膜能力的、高稳定型的超氧化物歧化酶的制备方法技术

本发明专利技术属于酶制剂的基因改造技术领域，具体涉及一种具有越膜能力的、高稳定型的超氧化物歧化酶的制备方法。本发明专利技术的方法，其特征在于，从嗜热脂肪地芽孢杆菌提取mRNA，利用反转录手段合成cDNA，设计特异性引物大量扩增其编码区，并连接到E.coli表达载体中，然后转化至工程菌BL21（DE3）中。利用点突变技术，增强超氧化物歧化酶的稳定性，并设计柔性多肽连接子GGGSGGGS，成功实现了越膜肽YGRKKRRQRRR与超氧化物歧化酶的可溶性融合表达。本发明专利技术的有益效果在于，通过本发明专利技术的方法所获得的超氧化物歧化酶，能最大程度的提高该酶的热稳定性；将HIV

【技术实现步骤摘要】
具有越膜能力的、高稳定型的超氧化物歧化酶的制备方法


[0001]本专利技术属于酶制剂的基因改造
，具体涉及一种具有越膜能力的、高稳定型的超氧化物歧化酶的制备方法。

技术介绍

[0002]超氧自由基是人类疾病与衰老的元凶，正常情况下，体内自由基的生成量比较小，可以由自身的抗氧化系统及时清除。但是当机体收到外机强烈刺激，微生物入侵、患病、熬夜、环境污染物刺激、紫外线照射、电离辐射等情况，自由基便无法得到及时清除，此时机体就会收到自由基的攻击而产生氧化性伤害。
[0003]基于上述的现象，需要在适当的时候合理利用外源性的超氧化物歧化酶，阻断自由基对人体的入侵，对保持健康极为重要。但是目前超氧化物歧化酶在应用方面存在四大瓶颈性的难题：第一是活性不够高，不具备终端产品的添加可行性；第二是稳定性不好，即使刚添加到终端产品时保持有一定活性，但是随着储存、运输等环节的时间推移，活性逐渐下降，等到达消费者手中时，已经无活性；第三是无法实现液体供应，目前市面上的超氧化物歧化酶全部是以冻干粉形式提供，在使用过程中需要定量复溶极不方便；第四是超氧化物歧化酶本身是生物大分子，即便是亚基的分子量也在20000以上，细胞透过性不好，不易被细胞吸收，不易对细胞内部的超氧自由基产生清除作用。
[0004]因此，需要针对上述的缺点进行改进，专利技术一种具有越膜能力的、高稳定型的超氧化物歧化酶，真正赋予超氧化物歧化酶在终端产品（包括抗氧化护肤品、皮肤类药品等）中应用的可行性。

技术实现思路

[0005]为了解决上述的技术问题， 本专利技术针对于上述
技术介绍
中所提及的四大卡脖子难题，真正赋予超氧化物歧化酶在终端产品（包括抗氧化护肤品、皮肤类药品等）中应用的可行性。
[0006]首先，本专利技术实现了超氧化物歧化酶的高活力，本专利技术可以使每毫升超氧化物歧化酶溶液中的活力高达5万单位；图16中，根据WST
‑
8测活方法，当测活体系中的超氧化物歧化酶能够抑制WST
‑
8自氧化速率达50%附近时，所测得的酶活力最准确。上图所示，该超氧化物歧化酶的酶活力为50000U/ml以上。
[0007]其次，本专利技术实现了超氧化物的高稳定性，其常温半衰期可达一年以上，即便是在50℃的高温环境，活力依然可以保持60天以上；如附图17所示。
[0008]再次，本专利技术实现了超氧化物歧化酶的液体供应，液体储存、液体运输；最重要的，本专利技术实现了超氧化物歧化酶的穿越细胞膜的能力。
[0009]本专利技术是通过如下的技术方案来解决上述的技术问题的：具有越膜能力的、高稳定型的超氧化物歧化酶的制备方法，其步骤如下：从嗜热脂
肪地芽孢杆菌提取mRNA，利用反转录手段合成cDNA，设计特异性引物大量扩增其编码区，并连接到E.coli表达载体中，然后转化至工程菌BL21（DE3）中。
[0010]本专利技术人对诱导条件进行摸索，可以确定其表达具有酶活力的蛋白，但是稳定性不够高。于是专利技术人利用点突变技术对其进行序列改造，经过摸索专利技术出一种可以大幅提高其热稳定性的序列。之后，专利技术人对其越膜能力进行改造，利用了越膜肽作为穿越细胞膜的能力，并摸索出连接越膜肽与超氧化物歧化酶的柔性连接子，最终专利技术出具有高活力、高稳定性、具有越膜能力的超氧化物歧化酶。
[0011]嗜热脂肪地芽孢杆菌是一种兼性厌氧菌，具有强力的抗氧化能力。CICC 收藏菌株为嗜热脂肪地芽孢杆菌编号为 CICC 10267 株，即 ATCC 7953 株，其在营养琼脂上56℃培养 24h 的菌落形态呈浅黄色，表面粗糙湿润，边缘不整齐。
[0012]具体的，具有越膜能力的、高稳定型的超氧化物歧化酶的制备方法，包括以下的步骤：（1）设计特异性引物序列从天然的嗜热脂肪地芽孢杆菌提取其编码超氧化物歧化酶的序列；（2）将（1）中克隆的超氧化物歧化酶的序列成功连接至原核表达载体中，并设计用于鉴定阳性克隆的引物；（3）获得表达菌株；本专利技术从嗜热脂肪地芽孢杆菌中克隆的超氧化物歧化酶的蛋白质氨基酸序列为：MPFELPALPYPYDALEPHIDKETMNIHHTKHHNTYVTNLNAALEGHPDLQNKSLEELLSNLEALPESIRTAVRNNGGGHANHSLFWTILSPNGGGEPTGELADAINKKFGSFTAFKDEFSKAAAGRFGSGWAWLVVNNGELEITSTPNQDSPIMEGKTPILGLDVWEHAYYLKYQNRRPEYIAAFWNVVNWDEVAKRYSEAKAK；以上的序列是本专利技术所要重点保护的内容；（4）利用NEB公司的点突变试剂盒，将第20位天冬氨酸突变为甘氨酸，并将141位的亮氨酸突变为天冬酰胺；（5）利用柔性多肽连接子GGGSGGGS，将HIV
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1肽段上具有越膜能力的CPP序列YGRKKRRQRRR与超氧化物歧化酶偶联表达，赋予其越膜能力。
[0013]进行点突变D20G与L141N点突变并且利用柔性多肽连接子GGGSGGGS将YGRKKRRQRRR序列与超氧化物歧化酶进行融合表达后，其氨基酸序列为： MPFELPALPYPYDALEPHIGKETMNIHHTKHHNTYVTNLNAALEGHPDLQNKSLEELLSNLEALPESIRTAVRNNGGGHANHSLFWTILSPNGGGEPTGELADAINKKFGSFTAFKDEFSKAAAGRFGSGWAWLVVNNGENEITSTPNQDSPIMEGKTPILGLDVWEHAYYLKYQNRRPEYIAAFWNVVNWDEVAKRYSEAKAKGGGSGGGSYGRKKRRQRRR；以上的序列，同样也是本专利技术所要重点保护的内容。
[0014]优选的，（1）设计特异性引物序列利用RNA提取试剂盒提取嗜热脂肪地芽孢杆菌的mRNA，然后利用反转录试剂盒合成了该微生物的cDNA，然后根据限制性内切酶位点优化特异性引物，钓取其编码超氧化物歧化酶的序列，优化特异性引物序列如下：超氧化物歧化酶钓取上游引物序列：5
’‑
CATATGCCCTTTGAACTACCAGCAT
‑3’
超氧化物歧化酶钓取下游引物序列：
5
’‑
AAGCTTCTTCGCTTTCGCCTCGCTG
‑3’
。
[0015]钓取的序列，就是下一步要表达的超氧化物歧化酶的编码序列，即为本专利技术的关键要点：ATGCCCTTTGAACTACCAGCATTACCCTATCCCTATGATGCTCTAGAACCGCACATTGACAAGGAGACCATGAACATCCACCACACCAAGCACCACAACACCTACGTGACCAACCTGAACGCGGCGCTGGAGGGTCACCCGGACCTGCAGAACAAAAGCCTGGAGGAACTGCTGAGCAACCTGGAGGCGCTGCCGGAAAGCATCCGTACCGCGGTTCGTAACAACGGTGGCGGTCACGCGAACCACAGCCTGTTTTG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.具有越膜能力的、高稳定型的超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，从嗜热脂肪地芽孢杆菌提取mRNA，利用反转录手段合成cDNA，设计特异性引物大量扩增其编码区，并连接到E.coli表达载体中，然后转化至工程菌BL21（DE3）中。2.如权利要求1所述的具有越膜能力的、高稳定型的超氧化物歧化酶的制备方法，包括以下的步骤：（1）设计特异性引物序列从天然的嗜热脂肪地芽孢杆菌提取其编码超氧化物歧化酶的序列；（2）将（1）中克隆的超氧化物歧化酶的序列成功连接至原核表达载体中，并设计用于鉴定阳性克隆的引物；（3）获得表达菌株；从嗜热脂肪地芽孢杆菌中克隆的超氧化物歧化酶的蛋白质氨基酸序列为：MPFELPALPYPYDALEPHIDKETMNIHHTKHHNTYVTNLNAALEGHPDLQNKSLEELLSNLEALPESIRTAVRNNGGGHANHSLFWTILSPNGGGEPTGELADAINKKFGSFTAFKDEFSKAAAGRFGSGWAWLVVNNGELEITSTPNQDSPIMEGKTPILGLDVWEHAYYLKYQNRRPEYIAAFWNVVNWDEVAKRYSEAKAK；（4）将第20位天冬氨酸突变为甘氨酸，并将141位的亮氨酸突变为天冬酰胺；（5）将HIV
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1肽段上具有越膜能力的CPP序列YGRKKRRQRRR与超氧化物歧化酶偶联表达，赋予其越膜能力；所述的CPP序列为Trans
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activating transcriptional activator序列。3.如权利要求1所述的具有越膜能力的、高稳定型的超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，（1）设计特异性引物序列步骤中，利用RNA提取试剂盒提取嗜热脂肪地芽孢杆菌的mRNA，然后利用反转录试剂盒合成该微生物的cDNA，再根据限制性内切酶位点优化特异性引物，钓取其编码超氧化物歧化酶的序列，优化特异性引物序列如下：超氧化物歧化酶钓取上游引物序列：5
’‑
CATATGCCCTTTGAACTACCAGCAT
‑3’
超氧化物歧化酶钓取下游引物序列：5
’‑ꢀ
AAGCTTCTTCGCTTTCGCCTCGCTG
ꢀ‑3’
。4.如权利要求1所述的具有越膜能力的、高稳定型的超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，（1）中，钓取的序列，即下一步要表达的超氧化物歧化酶的编码序列如下：ATGCCCTTTGAACTACCAGCATTACCCTATCCCTATGATGCTCTAGAACCGCACATTGACAAGGAGACCATGAACATCCACCACACCAAGCACCACAACACCTACGTGACCAACCTGAACGCGGCGCTGGAGGGTCACCCGGACCTGCAGAACAAAAGCCTGGAGGAACTGCTGAGCAACCTGGAGGCGCTGCCGGAAAGCATCCGTACCGCGGTTCGTAACAACGGTGGCGGTCACGCGAACCACAGCCTGTTTTGGACCATCCTGAGCCCGAACGGCGGTGGCGAGCCGACCGGTGAACTGGCGGACGCGATTAACAAGAAATTCGGCAGCTTTACCGCGTTCAAGGATGAGTTTAGCAAAGCGGCGGCGGGTCGTTTCGGTAGCGGTTGGGCGTGGCTGGTTGTGAACAACGGCGAGCTGGAAATCACCAGCACCCCGAACCAGGACAGCCCGATCATGGAGGGCAAGACCCCGATTCTGGGCCTGGATGTGT...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏勇，
申请(专利权)人：济宁医学院，
类型：发明
国别省市：