漆酶及其突变体和应用制造技术

本发明专利技术公开了漆酶及其突变体和应用。本发明专利技术提供了从土壤中分离得到的氨基酸序列为SEQIDNo.1所示的野生型漆酶。为了提高野生型漆酶酶活，将其进行了单位点或多位点突变，其中，L508F、L507M、H436E、R431D、R355K、T294E、N196D、H439Y、L77I、G405V、D372K、K296E、V519T、T166K、A46G、R187E、W502F、R236K、N367D、M158A、V366A或V241I单位点突变所获得的突变体，其酶活力显著提高；在单位点突变的基础上，本发明专利技术进行了多位点组合突变，分别得到了酶活力显著提高的三位点、五位点以及七位点组合突变体。五位点以及七位点组合突变体。五位点以及七位点组合突变体。

【技术实现步骤摘要】
漆酶及其突变体和应用


[0001]本专利技术涉及漆酶及其突变体，尤其涉及从土壤中筛选获得的酶比活力较高且偏中性的漆酶以及酶活力显著提高的酶突变体，属于漆酶及其突变体领域。

技术介绍

[0002]漆酶（Laccase，EC1.1.3.2）属于多铜氧化酶，其能利用铜离子的氧化作用催化广泛的底物，从而将氧气还原为水。漆酶具有对有毒异种生物化合物进行氧化生物修复的巨大潜力，其应用被认为对环境无害。因此广泛用于食品工业、染料脱色、制浆、漂白及造纸废水处理和生物修复等领域。
[0003]现有的漆酶多存在酶活力较低、在原核或真核表达中可溶性表达量低等缺陷，亟待改进。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的之一提供一种酶活力较高的漆酶；本专利技术的目的之二将所述的漆酶进行定点突变得到酶活力明显提高的单位点或多位点漆酶突变体；为实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案包括：一种从土壤中分离得到的漆酶，其氨基酸序列为（a）或（b）所示:(a)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或者(b)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有漆酶功能或活性的突变体。
[0005]本专利技术进一步提供了该漆酶的编码基因，该编码基因的多核苷酸序列为(a)：编码SEQ ID No.1所示氨基酸的多核苷酸；或者(b)：在(a)所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体所编码的蛋白仍具有漆酶的功能或活性。
>[0006]本专利技术发现，SEQ ID No.1所示氨基酸序列的漆酶也难以在酵母表达系统中外泌表达且在大肠杆菌中可溶性表达量极低，导致其酶活较低，严重影响了其应用。本专利技术在前期尝试优化表达条件，在该蛋白质 N 端增加了标签蛋白等，但其可溶性表达量仍然很低。
[0007]为了提高漆酶的可溶性表达量，本专利技术对SEQ ID No.1所示氨基酸序列的漆酶进行了单位点或者多位点突变，最终筛选得到了酶活力显著提高的单位点突变体以及多位点突变体。
[0008]作为本专利技术一种具体的实施方式，本专利技术提供了一种酶活力显著提高的漆酶单位点突变体，该突变体通过将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列进行L508F、L507M、H436E、R431D、R355K、T294E、N196D、H439Y、L77I、 G405V、D372K、K296E、V519T、T166K、A46G、R187E、W502F、R236K、N367D、M158A、V366A或V241I 中的任何一种氨基酸单位点突变所获得的突变体；优选的，将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列进行L508F、L507M、H436E、R431D、R355K、
T294E、N196D、H439Y或者L77I中的任何一种氨基酸单位点突变所获得的突变体；更优选的，将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列进行L508F、L507M、H436E、R431D、R355K、T294E或者N196D中的任何一种氨基酸单位点突变所获得的突变体；特别优选的，将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列进行L508F氨基酸单位点突变所获得的突变体。
[0009]本专利技术单位点突变体“L508F”表示将氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的漆酶的第508位氨基酸由亮氨酸（L）突变成苯丙氨酸（F）；本专利技术其余的单位点突变的表述依此类推。
[0010]作为本专利技术一种具体的实施方式，本专利技术提供了一种热稳定性提高的漆酶多位点突变体，所述多位点突变体选自以下(a）
‑
(c)中的任何一种：(a)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列同时进行L508F/L507M/H436E三个位点突变得到的三位点组合突变体（L508F/L507M/H436E）；(b)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列同时进行L508F/L507M/H436E/R431D/R355K五个位点突变得到的五位点组合突变体(L508F/L507M/H436E/R431D/R355K)；(c)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列同时进行L508F/L507M/H436E/R431D/R355K/T294E/N196D七个位点突变得到的七位点组合突变体(L508F/L507M/H436E/R431D/R355K/T294E/N196D)。
[0011]本专利技术多位点突变体“L508F/L507M/H436E”表示将氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的漆酶的第508位的亮氨酸（L）突变成苯丙氨酸（F），第507位的亮氨酸（L）突变成甲硫氨酸（M）以及将第436位的组氨酸（H）突变成谷氨酸（E）；本专利技术其他所述氨基酸多位点突变的表述依此类推。
[0012]所述的漆酶单位点突变体或多位点突变体的编码基因也属于本专利技术的保护范畴之内。
[0013]本专利技术还公开了含有所述漆酶单位点突变体或多位点突变体的编码基因的重组表达载体或重组宿主细胞；其中，所述重组表达载体可以为重组原核表达载体或重组真核载体。
[0014]本专利技术进一步提供了制备任何一项所述的漆酶突变体的方法，包括：（1）将所述漆突变体的编码基因可操作的与表达调控元件连接构建得到重组表达载体；（2）将重组表达载体转化宿主细胞，培养宿主细胞，诱导表达重组蛋白，纯化，即得。
[0015]本专利技术技术方案详述漆酶13B22的筛选及酶学性能检测漆酶13B22从农药污染的土壤中筛选获得，首先提取土壤宏基因组后构建fosmid文库，然后利用漆酶基因的保守序列设计简并引物，使用Tail
‑
PCR从宏基因组中得到了漆酶13B22的基因全长。将13B22的全长编码基因构建到大肠杆菌表达载体pET30a上，得到野生型质粒，热激转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。将携带重组基因的大肠杆菌 BL21 (DE3) 细胞在添加50 μg/mL卡那霉素的50 mL LB 培养基中，在30℃下以120 rpm振荡培养至OD
600
为 0.7～0.75。然后，将 0.1 mM 异丙基
‑
β
‑
d
‑
硫代吡喃半乳糖苷和 0.25 mM CuCl
2 添加到培养基中，并将温度降至25℃，继续孵育4 h，在此期间通过关闭摇动功能实现微需氧条件。在进一步生长 20 h后将菌液移至离心管中8000g 离心10 min收获细胞。将沉淀重新悬浮在
含有 20 mM Tris/HCl (pH 8.0) 的5 mL缓冲液中。在冰上超声破碎细胞，在4℃下以12,000 g离心30 min后将破碎上清液转移到新的预冷10 mL EP管中，使用镍柱纯化目的蛋白后测定漆酶活性。同时取少量样品制备SDS
‑
PAGE样品。将测定，漆酶13B22对漆酶底物2,2
‑
联氮
‑
二(3
‑
乙基
‑
苯并噻唑
‑6‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从土壤中分离得到的漆酶，其特征在于，其氨基酸序列为（a）或（b）所示:(a)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或者(b)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有漆酶功能或活性的突变体。2.权利要求1所述漆酶的编码基因，其特征在于，该编码基因的多核苷酸序列为：(a)编码SEQ ID No.1所示氨基酸的多核苷酸；或者(b)在(a)所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体所编码的蛋白仍具有漆酶的功能或活性。3.权利要求1所述漆酶的突变体，其特征在于，将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列进行L508F、L507M、H436E、R431D、R355K、T294E、N196D、H439Y、L77I、 G405V、D372K、K296E、V519T、T166K、A46G、R187E、W502F、R236K、N367D、M158A、V366A或V241I 中的任何一种氨基酸单位点突变获得所述的突变体。4.权利要求1所述漆酶的突变体，其特征在于，所述突变体是...

【专利技术属性】
技术研发人员：关菲菲，田健，伍宁丰，刘晓青，丁尊丹，王雨辰，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：