二羧酸合成相关酶及使用其生产二羧酸的方法技术

本发明专利技术涉及二羧酸合成相关酶、编码该酶的基因以及使用该酶生产二羧酸的方法。本发明专利技术的基因或由该基因编码的酶代替现有的二羧酸化学生产，可用于生物酶法生产二羧酸，因此预期具有高的工业实用性。具有高的工业实用性。具有高的工业实用性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】二羧酸合成相关酶及使用其生产二羧酸的方法


[0001]本专利技术涉及一种参与二羧酸(DCA)生产的酶、编码该酶的基因、包含该基因的载体以及使用该酶生产二羧酸的方法。

技术介绍

[0002]二羧酸(Dicarboxylic acid，DCA)是含有两个羧基基团(
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COOH)的有机化合物。二羧酸的分子通式可以用HO2C
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R
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CO2H来表示，其中R可以是脂肪族或芳香族基团。通常，二羧酸表现出类似于单羧酸的化学反应和反应性。二羧酸也用于制备共聚物，例如聚酰胺和聚酯。工业中使用最广泛的二羧酸是己二酸，它是用于生产尼龙的前体。二羧酸的其他例子包括天冬氨酸和谷氨酸，它们是人体中的两种氨基酸。此外，其他羧酸已用于各种工业领域。
[0003]此类二羧酸已通过化学工艺或生物方法制备。作为关于制备二羧酸的一个例子，作为二羧酸中的一种的癸二酸，即使使用苯酚和甲酚也可以合成它，但已知蓖麻油氧化是最环保且价格最具竞争力的方法。蓖麻油通过蒸汽裂解进行酯交换，并通过酯交换生产蓖麻油酸。将如此产生的蓖麻油酸在250℃下加热后与碱(例如熔融苛性钠等)混合，经苛性碱消化分解为辛醇(2
‑
辛醇)和癸二酸。将如此产生的产物纯化以得到高纯度癸二酸(美国专利第5,952,517和6,392,074号)。然而，这种方法的缺点是需要在300℃或更高的高温处理下才能达到上述目的，并且使用诸如硫酸的强酸，以及由于使用了诸如重金属、有毒有机溶剂等物质而产生大量的环境污染物。除了使用化学方法制备癸二酸外，还可以通过电解己二酸单乙酯钾(Potassium monoethyl adipate)来进行这种生产。
[0004]在之前的研究中，已经报道了使用ω
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氧化能力优异且β
‑
氧化被阻断的热带假丝酵母(Candida tropicalis)菌株通过生物方式来生产二羧酸。然而，没有关于具体二羧酸生物合成途径的报道。因此，确定二羧酸生物合成途径以开发能够大量生产二羧酸的有用菌株是重要的。
[0005]因此，本专利技术人已经发现通过使用产生二羧酸的热带假丝酵母菌株的进化方法来筛选与二羧酸生物合成相关的基因，并且使用这些基因来确定生物合成途径。因此，基于这些事实完成了本专利技术。
[0006][相关技术文件][0007][专利文件][0008]韩国专利申请第10
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2015
‑
0149253号
[0009][非专利文件][0010]David L.Craft等人，《应用与环境微生物学》，69(10)：5983
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5991，2003

技术实现思路

[0011]技术问题
[0012]因此，本专利技术的一个目的是提供一种参与二羧酸(DCA)生物合成的蛋白质，该蛋白质包括选自以下中的一个或多个：脂肪酶(LIP1)、细胞色素P450 52B1(CYP52B1)、NADPH
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细
胞色素P450还原酶(NCP1)、长链醇氧化酶(FAO1)和醛脱氢酶(ALD1)。
[0013]本专利技术的另一个目的是提供包含编码该蛋白质的基因的重组载体，以及包含该重组载体的用于生产二羧酸的组合物。
[0014]本专利技术的又一个目的是提供一种用于生产二羧酸的方法，该方法包括培养用包含该基因的载体转化的微生物。
[0015]技术方案
[0016]在以前的研究中，二羧酸的生产是通过化学方法进行的，并且大多数已知生产二羧酸的菌株都由于易受到底物的细胞毒性的影响而死亡。因此，通过生物方法生产二羧酸或确定二羧酸生产途径并不容易。于是，本专利技术人使用先前研究中的进化方法制造了对细胞毒性底物具有高耐受性并且产生二羧酸的菌株，并从该菌株中筛选了与二羧酸生物合成相关的酶和编码该酶的基因。因此，基于这些事实完成了本专利技术。
[0017]特别地，本专利技术提供一种参与二羧酸(DCA)生物合成的蛋白质，该蛋白质包括选自以下蛋白质中的一个或多个：脂肪酶(LIP1)、细胞色素P450 52B1(CYP52B1)、NADPH
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细胞色素P450还原酶(NCP1)、长链醇氧化酶(FAO1)和醛脱氢酶(ALD1)。
[0018]该蛋白质可以源自热带假丝酵母菌株，但本专利技术不特别限于此。
[0019]根据一个实施方式，热带假丝酵母菌株已知是产生作为二羧酸的一种的癸二酸的菌株，将该热带假丝酵母菌株在含有表现出细胞毒性的底物的培养基中培养以筛选在进化方面具有优异的在底物中存活能力的菌株，以及通过对筛选的菌株进行基因组分析，选择推测与二羧酸代谢相关的菌株的内源基因，即分别由SEQ ID NO：1
‑
5所示的碱基序列表示的脂肪酶基因、细胞色素P450 52B1(CYP52B1)基因、NADPH
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细胞色素P450还原酶(NCP1)基因、长链醇氧化酶基因和醛脱氢酶基因。结果证实，由该基因表达的酶在该酶在体外与底物发生酶促反应产生二羧酸。
[0020]脂肪酶可以由SEQ ID NO：1所示的基因表达；细胞色素P450 52B1(CYP52B1)可以由SEQ ID NO：2所示的基因表达；NADPH
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细胞色素P450还原酶(NCP1)可以由SEQ ID NO：3所示的基因表达；长链醇氧化酶可以由SEQ ID NO：4所示的基因表达；以及醛脱氢酶可以由SEQ ID NO：5所示的基因表达。
[0021]此外，分别由SEQ ID NO：1
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5所示的碱基序列表示的基因是包括一个或多个突变的基因，所述突变例如取代、缺失、易位、添加等。在这种情况下，每种由基因表达的酶还包括具有脂肪酶、细胞色素P450 52B1、NADPH
‑
细胞色素P450还原酶、长链醇氧化酶和醛脱氢酶的酶活性的基因。特别地，每种酶包括与SEQ ID NO：1
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5所示的碱基序列之一的序列同源性为80％或更多、85％或更多、90％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多以及99％或更多的碱基序列。
[0022]一个或多个基因可以被包括在载体中。载体可以是基因可以可操作连接的形式。在本专利技术中，术语“可操作连接”一般意指将碱基表达调控序列与编码所需蛋白质的碱基序列可操作连接以执行其功能，从而对编码所需蛋白质的碱基序列的表达产生影响。可以使用本领域已知的基因重组技术来实现载体的可操作连接，并且可以使用本领域已知的消化酶和连接酶等进行位点特异性DNA消化和连接。
[0023]在本专利技术中，术语“载体”是指任何用于将碱基克隆和/或转移到宿主细胞中的培养基。载体可以是可以与另一个DNA片段结合以复制结合片段的复制子。术语“复制子”是指
任何在体内作为DNA复制的自体单位起作用、也就是说可通过其自身调节进行复制的遗传单位(例如，质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病毒)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种参与二羧酸(DCA)生物合成的蛋白质，所述蛋白质包含选自以下中的一个或多个：脂肪酶(LIP1)、细胞色素P450 52B1(CYP52B1)、NADPH
‑
细胞色素P450还原酶(NCP1)、长链醇氧化酶(FAO1)和醛脱氢酶(ALD1)。2.根据权利要求1所述的蛋白质，其中，所述蛋白质源自热带假丝酵母(Candida tropicalis)菌株。3.根据权利要求1所述的蛋白质，其中，所述二羧酸是C6‑
C
20
二羧酸。4.根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白质，其中，所述脂肪酶(LIP1)由SEQ ID NO：1所示的基因表达；所述细胞色素P450 52B1(CYP52B1)由SEQ ID NO：2所示的基因表达；所述NADPH
‑
细胞色素P450还原酶(NCP1)由SEQ ID NO：3所示的基因表达；所述长链醇氧化酶(FAO1)由SEQ ID NO：4所示的基因表达；以及所述醛脱氢酶(ALD1)由SEQ ID NO：5所示的基因表达。5.一种用于二羧酸生物合成的组合物，所述组合物包含重组载体，所述重组载体包含选自由以下基因组成的组中的一个或多个基因：SEQ ID NO：1所示的基因；SEQ ID NO：2所示的基因；SEQ ID NO：3所示的基因；SEQ ID NO：4所示的基因；以及SEQ ID NO：5所示的基因。6.一种具有生产二羧酸(DCA)的能力的微生物，其中所述微生物用权利要求5中定义的组合物转...

【专利技术属性】
技术研发人员：金京宪，蒂鲁马莱萨米，
申请(专利权)人：高丽大学校产学协力团，
类型：发明
国别省市：